TWEAK-p38MAPK信号通路在人工关节假体周围骨溶解中的作用研究

发布时间：2017-12-29 23:30

  本文关键词：TWEAK-p38MAPK信号通路在人工关节假体周围骨溶解中的作用研究　出处：《南方医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景假体周围炎性骨溶解是人工关节置换术后的严重并发症。目前,大量研究提示无菌性松动主要与假体长期磨损或腐蚀产生的微粒所诱导的生物学反应有关。早在1977年Willert等人首先提出了假体无菌性松动是巨噬细胞对磨损微粒反应的结果。磨损微粒诱导人工关节周围组织内的单核巨噬细胞、成纤维细胞和滑膜细胞释放炎性细胞因子,引起一系列体内持续性炎性反应,促使局部破骨细胞增加,发生骨质吸收破坏,并最终导致假体的无菌性松动。近年来的研究提示,这些炎性细胞因子主要通过骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子(OPG/RANKL/RANK, Osteoprotegerin /Receptor Actibator of Nuclear Factor Kb Ligand /Receptor Actibator of NuclearFactor κB)信号系统激活破骨细胞,导致了假体周围骨量的丢失,产生骨溶解。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis, TWEAK)是1997年新发现的肿瘤坏死因子配体超家族中的一员。TWEAK在人体多种组织中均有表达,是一种广泛表达的肿瘤坏死因子家族的配体。多种免疫细胞(单核-巨噬细胞,树状突细胞,活化的T细胞等)均可产生其可溶性的细胞因子形式。在急慢性炎症或损伤的情况下,TWEAK表达显著增加。已经越来越多研究发现,TWEAK通过与其受体相结合,发挥各种各样的生物学效应,包括释放促炎性因子、调节免疫反应、刺激细胞凋亡以及调节组织修复与再生。TWEAK能促激活经典的核转录因子κB (Nuclear Factor κ BNF-κB)通路,除此之外,研究发现,TWEAK还可激活非经典的NF-κB通路以及丝氨酸/苏氨酸丝裂原激活蛋白(mitogen-ativated protein kinase, MAPK)激酶通路。MAPKs信号通路具有生物进化的高度保守性,广泛存在于细胞内,其主要功能是将细胞外刺激信号传递到细胞内,并引起细胞的一系列生物学反应。目前已发现细胞内有多条MAPK通路：细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK1/ERK2)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)通路(又称为应激活化蛋白激酶stress-activated protein kinase.SAPK).p38MAPK(p38α, p38β, p38γ and p38δ)通路和ERK3/ERK4/ERK5通路。其中p38 MAPK是MAPK家族的重要成员,当他们受到环境应激或细胞因子刺激时,能使效应细胞产生增殖、分化、迁移、浸润和炎症等生命活动。p38 MAPK的抑制剂SB203580,为吡啶咪唑类衍生物,能特异性地作用于p38 ATP结合活性位点Thr106,使p38失去了与ATP结合的能力,从而使其失去激酶活性。白介素-6(Interleukin 6, IL-6)是一种多功能的细胞因子,主要由单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等分泌,发挥一系列的免疫效应。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemiattractant protein 1.MCP-1)属于趋化因子超家族的一员,其主要功能是通过趋化作用,使单核细胞离开血流而分化成为分布于组织中的巨噬细胞,参与着机体的免疫和炎症反应。研究表明这些因子都参与着关节置换术后假体周围无菌性松动的病理过程随着对炎性骨溶解研究的深入,特别是在溶骨性因子,受体／配体家族成员及其细胞内信号传导通路对破骨前体细胞分化、成熟及破骨细胞活化、功能影响方面研究的进展,针对骨溶解机制中某一环节进行干预成为可能。目前已有少量文献报道,p38 MAPK信号通道参与了磨损微粒诱导的骨溶解这一病理过程,Zwerina等人通过风湿性关节炎的小鼠模型研究,不仅发现p38MAPK对于炎性骨破坏起着重要作用,同时还发现抑制p38MAPK是减轻炎性骨破坏的重要手段。此外,在临床上对狼疮肾炎、肌炎等疾病的研究中发现,p38 MAPK信号通道能被TWEAK激活,并发挥致病作用。但是p38 MAPK信号通道在人工关节置换术后假体松动的界膜组织中如何表达,尚存在争议。而TWEAK作为TNF配体超家族的成员是否也参与假体周围无菌性松动的发生和发展,尚未见文章报道。基于以上的理论支撑,本研究拟通过组织形态学观察及分子生物学实验方法,探讨人工关节假体周围骨溶解的相关问题。1.在松动假体周围界膜组织中,TWEAK和p38 MAPK表达情况,探讨其表达与假体松动的相关性。2.用钛微粒刺激体外培养巨噬细胞(RAW246.7),通过p38 MAPK抑制剂进行干预,观察TWEAK及p38 MAPK的表达,探讨TWEAK-p38 MAPK信号通过在其中可能的作用机制。3.制备小鼠颅骨骨溶解的动物模型,用p38MAPK抑制剂进行干预,观察TWEAK及p38MAPK的表达,探讨TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信号通道在炎性骨溶解中的作用,以及p38 MAPK抑制剂对人工关节无菌性松动靶向治疗的可能性。一. TWEAK及p38 MAPK在关节松动假体周围界膜组织中的表达及临床意义方法：研究不同来源的滑膜组织及松动假体周围界膜组织(正常滑膜、骨关节炎滑膜、界膜),通过HE染色和免疫组织化学染色,对组织标本进行定性观察。通过RT-PCR和Western Blot等分子生物学实验方法检测组织中TWEAK及p38MAPK的表达,对组织标本进行定量观察。结果：HE染色结果显示,与正常滑膜组比较,骨关节炎滑膜组基质和纤维细胞较多,少许炎性细胞浸润,镜下见滑膜细胞,但其增生不明显。而在界膜组中滑膜细胞增生明显伴有局灶性炎性细胞浸润,显微镜下可见有大量的单核细胞,在细颗粒状物周围尤为明显。TWEAK的免疫组化染色结果显示,界膜组中可见大量胞质呈棕黄色的单核细胞(阳性细胞)；骨关节炎滑膜组中可见散在的胞质呈棕黄色的单核细胞；正常滑膜组中阳性细胞更少。p-p38 MAPK的免疫组化染色结果与TWEAK镜下观察结果类似。在界膜组的TWEAK mRNA以及蛋白的表达要明显高于正常滑膜组及骨关节炎滑膜组,并且骨关节炎滑膜组的TWEAK mRNA以及蛋白表达水平亦高于正常的滑膜组。p-p38MAPK蛋白表达情况与TWEAK表达类似,在界膜组中最高,关节炎组次之,正常滑膜组最少,两两比较均由统计学差异。TWEAK和p-p38MAPK表达呈正相关。结论：TWEAK可能是炎性骨溶解的启动因素之一,p38 MAPK可能是参与调控磨损微粒诱导骨溶解的中心环节,进一步探索TWEAK及P38MAPK在假体周围炎性骨溶解中的作用机制,对临床防治人工关节无菌性松动具有重要意义。二. p38 MAPK抑制剂对钛微粒刺激巨噬细胞分泌炎性因子的影响方法：体外培养巨噬细胞(RAW246.7),分组：A组：对照组(细胞单纯培养组),B组：A+SB203580(特异性p38MAPK阻断剂),C组：A+TiPs,D组：A+TiPs+SB203580.将上述各组分别加入24孔培养板,在5%CO2,37℃,95%湿度条件下孵育48小时候收集细胞及细胞培养上清。采用Western Blot分别检测TWEAK及p-p38MAPK的蛋白表达水平。采用ELISA法分别检测细胞培养上清中IL-6, MCP-1表达水平。结果：TWEAK蛋白的表达：C组较A组、B组和D组明显增加(P0.05)。且D组较A组B组明显增加(P0.05)。p-p38MAPK蛋白表达：C组明显高于A组,B组及D组(P0.05)。A组明星高于B组、D组(P0.05),B组,D组两组间没有明显差异。细胞培养上清中,IL-6和MCP-1的表达：C组较A组、B组和D组明显增加(P0.05),A组,B组两组间没有明显差异。结论：钛微粒能刺激巨噬细胞通过激活p38 MAPK信号通路分泌炎性因子,而SB203580能通过抑制p38 MAPK,减轻巨噬细胞的炎性因子分泌,因此推测TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信号通道在微粒诱导的炎性骨溶解中发挥着重要作用。进一步探索p38 MAPK信号通路,对临床防治人工关节无菌性松动具有重要意义。三. p38 MAPK抑制剂对钛微粒诱导炎性骨溶解的实验研究方法：雄性C57BL/J6小鼠体重18-22g,12-14周龄。随机分成：假手术组(A组)、SB203580组(B组)、TiPs植入组(C组)和TiPs植入+SB203580组(D组),SB203580以0.1mg/kg/d腹膜内注射。术后两周取材,采用TRAP染色观察骨溶解动物模型里的破骨细胞形态及数量,ELISA法检测动物模型的炎性细胞因子。结果：TRAP染色结果显示,在C组(TiPs的颅骨模型)可见大量破骨细胞形成,呈紫红色,散在或者连续存在。而没加TiPs的A组和B组中,均没见到破骨细胞及骨破坏。在D组(TiPs+SB203580的颅骨模型)中,仅在颅骨溶解边缘有少量紫红色细胞,阳性细胞较C组明显减少。颅骨骨破坏也较C组明显减轻。ELISA结果显示,C组在钛微粒的刺激诱导下,TWEAK、p-p38MAPK、IL-6和MCP-1的含量要明显高于其他三组(P0.05)。而D组由于有SB203580的干预,不仅p-p38MAPK得到了明显的抑制,TWEAK, IL-6, MCP-1表达也明显减少。与C组相比差异具有统计学意义。其余三组之间差异没有统计学意义。结论：SB203580能通过抑制p38MAPK信号通路,降低炎性因子的表达,抑制破骨细胞的生成,减轻钛微粒诱导的炎性骨溶解。因此,我们认为,TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信号通道在微粒诱导的炎性骨溶解中发挥着重要作用。抑制p38 MAPK信号通路可能成为抑制炎性骨溶解的新途径,进一步研究p38MAPK信号通路对临床防治人工关节无菌性松动具有重要意义。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687.4
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本文编号：1352389