二甲双胍与ABT-263协同促进p53功能缺陷型肿瘤细胞凋亡的作用及机制研究

发布时间：2017-12-30 00:16

  本文关键词：二甲双胍与ABT-263协同促进p53功能缺陷型肿瘤细胞凋亡的作用及机制研究　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景:肿瘤抑癌基因TP53(tumor protein 53)的编码蛋白p53可以通过促进细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,介导细胞衰老等多种方式发挥抑癌作用。p53功能在大约半数的人类肿瘤中都存在障碍,主要原因是由于TP53基因缺失或基因突变(包括显性失活、杂合性缺失等),在某些肿瘤类型中,p53蛋白也会因过度降解而被废除正常功能。无论是TP53基因完全缺失,显性失活,杂合性缺失,或者p53蛋白功能被废除,都可以导致野生型p53功能丧失,这些可以统称为p53功能缺陷。临床前研究表明p53功能缺陷的肿瘤模型对多种抗肿瘤药物产生化疗抵抗,且p53功能缺陷的病人在临床中的预后普遍较差。尽管在很多实验模型中,重新活化p53展现出了一定的抑癌效果,但在临床中针对p53功能缺陷的肿瘤仍然缺少有效的靶向治疗措施。这一重要的问题亟待解决。小分子BCL-2抑制剂ABT-263(具有口服活性)及其类似物ABT-737可以特异地靶向BCL-2家族抗凋亡蛋白(BCL-XL和BCL-2等),释放BCL-2家族促凋亡蛋白活性,进而诱导肿瘤细胞凋亡。在临床前研究中,ABT-263作为单药或联合其他肿瘤治疗药物均展示了较好的效果。而且在多种类型肿瘤中以ABT-263为基础的临床试验正在开展中且具有潜在的治疗前景。目前,ABT-263或ABT-737治疗过程中诱导BCL-2家族另一个抗凋亡蛋白MCL-1的水平升高是其主要抵抗因素之一。此外,有研究表明ABT-737单药对于p53功能缺陷的基因工程鼠的肿瘤发生发展只有很小的抑制作用,且p53的功能缺陷严重削弱了ABT-737的促凋亡作用。BCL-XL/BCL-2抑制剂ABT-263在p53功能缺陷型肿瘤中的凋亡抵抗机制有待进一步阐明,相应增敏措施也亟待解决。二甲双胍(metformin)是临床上广泛使用的糖尿病治疗药物,近年来其在肿瘤研究中的作用备受关注。二甲双胍发挥抑癌作用的机制之一是通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶点复合体1(mTORC1)。有趣的是,p53对于二甲双胍发挥抗癌效应的作用是双向的:有研究报道,p53对于二甲双胍在乳腺癌细胞中诱导凋亡和衰老等是必须的。而另外的研究报道,二甲双胍对p53功能缺陷型肿瘤细胞也具有杀伤作用。基于以上研究报道,探究ABT-263在p53功能缺陷型肿瘤细胞中的凋亡抵抗因素,及二甲双胍是否可以和ABT-263协同杀伤p53功能缺陷型肿瘤细胞,是一项新颖而有意义的研究。目的:本研究以p53功能缺陷型及p53野生型肿瘤细胞系为模型,拟通过相关实验方法,探讨二甲双胍及ABT-263联合使用对其凋亡的诱导作用及相应分子机制。以期为二甲双胍和ABT-263的抗肿瘤作用提供新的依据,同时为基于联合应用二甲双胍和ABT-263特异性靶向治疗p53功能缺陷型肿瘤提供理论基础。方法:1.在p53功能缺陷型肿瘤细胞系中,使用不同浓度梯度的二甲双胍及ABT-263组合,通过CCK-8试验检测细胞活力,确定最适的联用浓度;进而通过流式细胞术,Western blot检测剪切型PARP等方法分析凋亡,探究在p53功能缺陷型细胞系中二甲双胍和ABT-263是否具有协同促凋亡作用;2.通过Western blot筛选可能介导二甲双胍和ABT-263协同作用的BCL-2家族及IAPs家族抗凋亡分子,进而分别转染相应的干扰序列或过表达质粒,通过模拟和回复实验证实这些分子所起的作用;3.应用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)技术,探究在二甲双胍和ABT-263的单独及联合作用下,BCL-2家族抗凋亡与促凋亡分子之间的相互作用变化以及IAPs家族分子与CASPASE家族分子之间的相互作用变化;4.应用qRT-PCR技术,探究二甲双胍及ABT-263单独或联用对MCL-1,XIAP及SURVIVIN等mRNA表达水平的影响;5.应用翻译抑制剂CHX,探究二甲双胍及ABT-263单独或联用对MCL-1,XIAP及SURVIVIN等的蛋白水平是否存在翻译后(即蛋白降解水平)的影响;6.使用Western blot筛选可能介导二甲双胍和ABT-263协同促凋亡作用的翻译相关信号通路;7.运用Co-IP及7-甲基-GTP帽结合(m7-GTP cap binding)分析技术,探究二甲双胍及ABT-263联合应用对于cap依赖的蛋白翻译的作用;8.使用不同的mTOR抑制剂,探索介导二甲双胍和ABT-263影响cap依赖性翻译的具体mTOR下游效应分子;9.使用HCT-116的p53野生(HCT-116 p53+/+)及p53缺失(HCT-116 p53-/-)细胞对,分别探索联用二甲双胍及ABT-263在p53功能缺陷和正常的肿瘤细胞中的促凋亡效应,进而应用Western blot分析可能的分子机制;10.运用Co-IP及m7-GTP cap binding分析技术,探索在p53功能正常的情况下二甲双胍和ABT-263单独及联合应用对cap依赖的翻译的影响;11.分别运用细胞衰老相关β半乳糖苷酶染色和qRT-PCR,探索在p53功能缺陷和正常的情况下,二甲双胍和ABT-263单独及联合应用对于细胞衰老和细胞衰老相关分泌表型的影响;12.使用在两种模型中差异表达的促癌炎性细胞因子中和抗体或NF-κB抑制剂,进一步证实细胞衰老相关分泌因子在介导p53野生型肿瘤细胞抵抗二甲双胍联用ABT-263促凋亡作用中的重要性;13.建立p53野生型及p53功能缺陷型荷瘤鼠模型,单独或联合使用二甲双胍及ABT-263探究其对相应肿瘤的生长抑制作用,进而使用Western blot解析具体分子机制;结果:1.二甲双胍和ABT-263在多种p53功能缺陷型肿瘤细胞中可以显著协同促进细胞凋亡;2.二甲双胍通过下调ABT-263诱导的MCL-1,XIAP及SURVIVIN增敏ABT-263的促凋亡作用;ABT-263通过抑制BCL-XL从而释放游离BIM进而增敏二甲双胍;3.二甲双胍通过抑制mTORC1的下游效应分子p-4EBP1抑制cap依赖的翻译,进而下调ABT-263诱导的MCL-1和SURVIVIN蛋白水平;二甲双胍同时通过抑制p-EIF4E从而抑制cap非依赖(IRES依赖)的翻译,进而下调ABT-263诱导的XIAP蛋白水平;4.在p53野生型肿瘤细胞中,二甲双胍和ABT-263的联合处理异常活化了4EBP1—MCL-1/SURVIVIN信号通路,使得二者无法协同促凋亡;5.在p53野生型肿瘤细胞中,p53介导的细胞衰老相关分泌表型(SASP)异常活化了4EBP1—MCL-1/SURVIVIN通路,导致对二甲双胍和ABT-263的联用治疗抵抗;6.在异种移植裸鼠肿瘤模型中,联用二甲双胍和ABT-263协同抑制p53功能缺陷型(而非p53野生型)肿瘤的生长,其机制与细胞实验吻合;结论:在p53功能缺陷型肿瘤细胞中,二甲双胍与ABT-263可以通过整合凋亡机器和翻译机器协同诱导细胞凋亡,抑制肿瘤生长;而在p53野生型肿瘤细胞中,二者无协同促凋亡作用。本研究为以二甲双胍和ABT-263联合应用特异性靶向治疗p53功能缺陷型肿瘤提供了新的科学依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R73-36

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本文编号：1352497