HBV与多重耐药蛋白MDR1的相互作用及其机制研究

发布时间：2018-01-01 09:17

  本文关键词：HBV与多重耐药蛋白MDR1的相互作用及其机制研究　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重危害全人类公共健康的常见传染病。但目前尚无治疗方法能彻底清除慢性HBV感染;同时也缺乏对HBV发病机制进行深入研究的、较好的体内或体外模型。因此,直接从人肝组织样本入手仍是现阶段探索和认识慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)发生、发展机制和治疗方法的最佳途径。我们拟通过本研究筛选出在CHB患者肝组织内差异表达的蛋白质(differentially expressed proteins,DEPs),并寻找到在阐明宿主-病毒相互作用机制方面发挥至关重要作用的新蛋白质。进一步深入研究目的差异蛋白在HBV转录、复制中的作用,以及HBV调控目的差异蛋白的可能分子机制。方法:通过同位素标签的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)耦合液相色谱-二维串联质谱分析(liquid chromatography and two dimensional tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术对CHB患者的肝穿刺组织和未感染HBV人群的肝组织进行差异蛋白质组学分析,从而鉴定出可能参与宿主-病毒相互作用的蛋白改变;并采用定量逆转录-聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)的方法对质谱分析结果进行验证;最终确定拟于下一步深入研究的目的deps,进而在多个体外细胞模型中确认目的deps的表达。接下来,通过脂质体瞬时转染技术,将目的差异蛋白的sirna转入hepg2.2.15细胞,干扰其在hbv细胞中的表达;再采用qpcr、wb、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)等方法检测hbv复制中间体及hbv相关标志物的表达变化情况,进而明确目的差异蛋白在hbv转录、复制过程中所发挥的作用。最后,采用分别转染不同片段hbv质粒的方法,寻找到对目的差异蛋白的表达起调控作用的病毒蛋白,并在chb患者肝组织中通过免疫组化(immunohistochemicalanalysis,ih)的方法验证病毒蛋白和目的差异蛋白之间的这种关系;再使用转录因子芯片的方法筛选出在该病毒蛋白和目的差异蛋白之间起中间作用的tf,并用qrt-pcr、wb的方法验证芯片结果;进而运用双荧光素酶报告基因、凝胶迁移电泳实验(electrophoreticmobilityshiftassay,emsa)等技术验证目的tf在这一过程中的作用。结果:我们成功鉴定出1486个蛋白质,筛选其中至少在12例chb患者肝穿刺组织中表现出相同趋势(表达同时上调或下调)的deps71个(53个在chb患者肝穿刺组织中表达上调,另外18个则下调)。进一步qrt-pcr和wb验证的结果与质谱分析一致。在此基础上,结合uniprot、panther和pubmed等多个数据库的综合检索结果,我们选择了mdr1作为接下来深入研究的目的蛋白;并在hepg2、hepg2.2.15、huh7和hepad38等多个人肝癌细胞系中再次从mrna、蛋白水平确认了mdr1在hbv感染细胞株中的高表达(p0.05)。接下来,我们成功干扰了人肝癌细胞株HepG2.2.15中MDR1的表达(P0.05)。在转染了ABCB1 siRNA的HepG2.2.15细胞中,3.5kb mRNA的表达水平相对于转染对照siRNA的HepG2.2.15细胞而言,显著降低(P0.05);而HBV复制中间体,以及包括HBs Ag、HBe Ag和HBc Ag等在内的HBV相关标志物则没有显著改变(P0.05)。最后,我们发现在过表达HBV大表面抗原(HBV large surface protein,LHBs)的人肝癌细胞株中,MDR1的表达明显上调(P0.05);CHB患者肝组织中MDR1的表达量也与患者血清LHBs浓度呈正相关(r2=0.76,P0.0001)。进一步的转录因子芯片筛选出缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)可能是LHBs调节MDR1表达的中间TF;qRT-PCR、WB检测也分别从mRNA、蛋白水平证实了芯片的结果。最后,我们采用双荧光素酶报告基因、Electrophoretic mobility shift assay,EMSA的方法证实了HIF-1α确实是LHBs调控MDR1表达的中间TF。结论:相对于未感染HBV人群的肝组织而言,CHB患者肝穿刺组织中的MDR1高表达。并且在多个感染了HBV的人肝癌细胞系中,也发现MDR1的表达量相对于未感染的同源细胞株明显增高。MDR1确实可以调节HBV转录、复制的过程;并且MDR1对HBV转录、复制的调控主要是通过对3.5kb mRNA的影响而实现的。而HBV对MDR1的调控是通过病毒蛋白LHBs对转录因子HIF-1α的作用而实现的。提示MDR1可能是未来治疗HBV的一个潜在药物靶点。
[Abstract]:鐩�鐨�:涔欏瀷鑲濈値鐥呮瘨(hepatitis B virus,HBV)鎰熸煋鏄�涓ラ噸鍗卞�冲叏浜虹被鍏�鍏卞仴搴风殑甯歌�佷紶鏌撶梾.浣嗙洰鍓嶅皻鏃犳不鐤楁柟娉曡兘褰诲簳娓呴櫎鎱㈡，

本文编号：1363883