经APTES共价修饰后的细胞膜色谱新技术的研发及应用

发布时间：2018-01-01 11:34

本文关键词：经APTES共价修饰后的细胞膜色谱新技术的研发及应用　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞膜色谱(Cell Membrane Chromatography,CMC)是一种将细胞膜提取后键合到固定相表面的生物色谱,它结合了生物材料的生物学活性以及传统分析色谱法在线分离、高通量的优势,使得从中药等复杂体系中筛选出有效的活性成分成为可能,而且更加高效、便利。中药具有整体性、复杂性的特点,这些特点赋予了它多靶点、多途径调节的优势和特色。然而,正是由于这些特性,导致中药中的主要活性成分并不明确,其作用效果和现代理论基础也较为薄弱,主要的临床应用仍旧依赖几千年来无数中医前辈所积累的经验所推理得到的富含辩证关系的中医理论。细胞膜色谱作为一种新兴的生物色谱技术,在中药活性筛选的研究领域得到了较为广泛的应用。本研究在原有细胞膜色谱模型基础之上进行了创新,研发出一种新型的经APTES修饰后的细胞膜色谱模型,并对新型细胞膜色的模型的方法学进行了考察和优化,在中药活性成分筛选领域内多方面开展了应用研究,从而为细胞膜色谱制备的进一步科学化、规范化、合理化提供依据,并有利于进一步拓展细胞膜色谱的应用范围。1.新型经APTES修饰的细胞膜色谱方法学的建立及考察细胞膜色谱是一种新型的生物亲合色谱,该模型使用特定细胞膜键合于硅胶上作为色谱固定相。但是细胞膜色谱存在寿命较短,易失活等问题,一直以来影响细胞膜色谱的普及。除此以外,由于不同实验室制备条件不一致,还存在重现性较差的问题。因此本章针对细胞膜色谱柱寿命较短的问题,创新性地采用了一种新型的经过(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,APTES)共价修饰后的硅胶应用到了细胞膜色谱的制备过程中。本研究首次提出使用共价修饰的方法,研发新型的细胞膜色谱技术。其原理就是利用APTES作为桥梁,在硅胶表面键合了醛基,该醛基可以与细胞膜上丰富的氨基基团以共价键的形式结合。通过这种方式,细胞膜和硅胶间的结合力将会极大增强,从而使得细胞膜的脱落失活现象得到一定程度的缓解。经实验考察,所制备的新型的经APTES共价修饰的细胞膜色谱柱可以具有更高的柱效和更长的寿命,从原有的不足3天提高到现在的12天左右。为了解决重现性较差的问题,本研究还对新建立的经APTES共价修饰的细胞膜色谱法进行了方法学考察,对细胞膜色谱制备过程的关键步骤进行了考察,如细胞量、细胞破碎条件等,并制定了相应的用量标准和操作规程。2.经APTES修饰的MCF7全二维细胞膜色谱的构建及其应用为进一步扩展在第一章基础上所搭建好的经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型的应用,并探索阐明中药元胡的抗癌作用机制,筛选中药元胡中的潜在抗癌活性成分或者药物前体,在本章中,拟选用元胡作为中药材的研究对象,通过使用MCF7细胞系构建经APTES修饰的MCF7细胞膜色谱,在线对元胡提取液中的各组分进行高通量筛选。在确保APTES修饰的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系统的稳定性、选择性的基础上,我们从中药元胡中筛选鉴别到了3种潜在活性化合物,即氧海罂粟碱、普鲁托品、小檗碱。这三种活性成分可以有效地对MCF7细胞进行浓度依赖性的杀伤,其在MCF7细胞中的IC50值分别为36.16μM、29.30μM和45.52μM;且经过细胞凋亡和死亡实验进行考察后发现,这三种活性成分主要是通过诱导细胞凋亡来发挥药效的。本研究结果表明所构建的经APTES修饰后的2D MCF7/CMC-C18柱/TOF-MS系统是一种用于中药抗乳腺癌活性成分筛选的可行方法。3.经APTES修饰的DU145全二维细胞膜色谱的构建及其应用为进一步确证经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型的有效性,从而为细胞膜色谱的进一步发展应用探索道路,本章在第一章、第二章基础上所搭建好的经共价修饰后的新型细胞膜色谱模型基础上,探索筛选中药元大黄、黄芩中的潜在抗癌活性成分或者药物前体。在本章中,拟选用大黄和黄芩作为中药材的研究对象,通过使用经APTES修饰后的硅胶,构建了2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS系统,在线对大黄和黄芩提取液中的各组分进行高通量筛选。在确证经APTES修饰的2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS系统的选择性、适用性的基础上,我们从中药大黄和黄芩中筛选鉴别到了三种潜在活性化合物,即木蝴蝶素A、丹叶大黄素和大黄素。经过细胞增殖实验的考察,发现这三种活性成分均可以有效地对DU145细胞进行浓度依赖性的杀伤,其在DU145中的IC50分别为151.1μM、55.66μM和85.81μM;且经过细胞凋亡和死亡实验进行考察后,进一步确证了这三种活性成分的药效,并发现其药效作用主要是通过诱导细胞凋亡来发挥药效的。本研究结果表明所构建的经APTES修饰后的2D DU145/CMC-C18柱/TOF-MS分析系统是一种从中药中筛选抗前列腺癌活性成分的可行方法。4.经APTES修饰的全二维HepG2干细胞膜色谱系统的构建及其应用最近一段时间,肿瘤干细胞的研究在抗癌研究领域引起了人们的广泛关注。它们是一类具有自我更新能力的特殊肿瘤细胞,在肿瘤的复发、转移和迁移中发挥着重要作用。杀死肿瘤干细胞将会显著提高肿瘤的治愈率,同时也能大大降低肿瘤的复发率。但是通常来说分离和培养肿瘤干细胞是十分困难且耗时的过程,获得足够量的肿瘤干细胞进行相关研究时,对我们的实验要求也更高、更苛刻。而我们新建立的APTES修饰的细胞膜色谱寿命长、效率高,恰好十分适用于肿瘤干细胞。因此在本研究中,我们通过APTES修饰的硅胶建立了一种新的HepG2-CSC/CMC,并选择一种著名的中药丹参(Salvia miltiorrhiza,其炮制部位为唇形科植物丹参的干燥根和根茎)作为理想的中药复杂体系进行活性成分筛选。有报道研究证明,在1981至2006年之间,临床上70%的新批药物来源于天然产物。因此从中药中筛选出潜在的具有抗肿瘤干细胞的活性成分是一项很有前景的研究。此外,根据本课题组的前期研究报道,我们还拟采用全二维色谱法,以进一步提高CMC的分离度。在这些条件下,本研究搭建了一个经APTES共价修饰的HepG2肿瘤干细胞细胞膜色谱全二维分析系统,对丹参中的活性成分进行了筛选,得到了丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ这三种潜在活性成分。结合后期的细胞增殖抑制实验考察得到其IC50值分别为10.300μM,17.850μM,2.53μM,然后通过细胞凋亡实验进一步确证其药效,并利用虚拟对接技术,确证其潜在药效作用靶点可能为细胞膜上的VEGFR。使用经APTES修饰的硅胶构建的全二维细胞膜色谱是一种有效的从复杂体系(如中药等)中筛选具有潜在抗癌活性的目标化合物的新方法,特别是对于一些珍稀的、较难以获得的生物材料。总之,针对细胞膜色谱应用过程中所面临的柱寿命短、稳定性差的问题,本课题通过对硅胶表面进行共价修饰,创新性地利用APTES在硅胶表面键和醛基从而与细胞膜表面大量的游离氨基形成共价键,首次通过共价修饰的方式延长了细胞膜色谱柱寿命并提高其稳定性。后续系统考察优化了细胞膜色谱制备方法学,制订了一系列标准,从而保证新搭建的细胞膜色谱模型的重现性。在此基础上构建新型MCF7、DU145和HepG2干细胞的全二维细胞膜色谱分析系统应用于中药抗肿瘤活性组分的筛选,大大提升了通量,筛选到抗乳腺癌、抗前列腺癌癌和专属性杀伤肝癌干细胞的活性成分。通过本课题的相关研究,研发出了一套新型的经APTES修饰的细胞膜色谱模型,进一步扩展了细胞膜色谱的应用范围,也为中药活性成分的高通量筛选提供了新的理念和借鉴。
[Abstract]:A new type of biological affinity chromatography ( APTES ) has been developed on the basis of cell membrane chromatography . In this chapter , we identified three potential active compounds , namely , xylinecine A , protopine , berberine . The IC50 values of the modified 2D MCF7 / CMC - C18 column / TOF - MS system were studied . In this study , we have established a new method for screening the active components of the cell membrane by APTES modified silica gel .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O652.6;R284

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