槐定酸类新化合物抗肝癌作用的分子机理及GSK-3β调控肝癌的机制研究

发布时间：2018-01-04 16:36

本文关键词：槐定酸类新化合物抗肝癌作用的分子机理及GSK-3β调控肝癌的机制研究　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子中提取分离的一类喹诺里西啶类生物碱,具有抗肿瘤、抗炎等药理活性。槐定碱作为我国自主研制的1.1类新药,于2005年被SFDA批准上市,主要用于绒癌、恶性葡萄胎等恶性滋养细胞肿瘤的治疗。在我们长期从中药中寻找抗肿瘤活性药物的探索过程中发现,尽管槐定碱具有良好的药代动力学性质和显著稳定的临床抗肿瘤疗效,但也存在抗瘤谱较窄、具有一定的神经毒性等问题。目前,对于槐定碱的结构优化及活性研究仍旧较少。我们将槐定碱的四环结构开环后,得到一系列三环槐定酸类衍生物,对其进行抗肿瘤活性及作用机制的初步研究。首先以人肝癌HepG2细胞为目标筛选系,对自主合成的200余个槐定酸类衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选,我们发现了结构稳定、安全性高、抗肿瘤活性好的新衍生物IMB-6G。激活内质网应激引起细胞凋亡是很多抗肿瘤药物的作用机制,在本部分研究中,我们主要考察IMB-6G是否通过内质网应激途径发挥其抗肿瘤作用。选取人肝癌细胞HepG2和SMMC7721为研究对象,首先采用细胞活力测定、免疫印迹、激光共聚焦、流式细胞术等多种方法证实IMB-6G可诱导线粒体依赖性肝癌细胞凋亡的发生,而后对内质网应激途径中的重要分子伴侣GRP78/Bip和促凋亡作用执行因子CHOP的表达情况进行了检测,WB结果表明,IMB-6G可时间和浓度依赖性的升高Bip和CHOP的表达,同时RT-PCR的结果表明Bip和CHOP的mRNA的水平也明显升高,这提示我们IMB-6G可能激活了细胞的内质网应激途径。研究表明,细胞中CHOP蛋白的表达升高是PERK-eIF2α途径激活的直接结果,我们检测到IMB-6G作用之后PERK及eIF2α的磷酸化水平均明显升高,初步证明了 IMB-6G对PERK途径的激活作用。同时,双荧光素酶报告基因的方法也检测到IMB-6G作用之后CHOP启动子区的活性增强。而后siRNA沉默PERK及CHOP的表达,IMB-6G引起细胞凋亡均明显减少,说明了激活的PERK及CHOP对于IMB-6G发挥促细胞凋亡的重要作用。在IRE1α途径中,我们首先检测到IMB-6G可以激活IRE1α。由于TRAF6-ASK1-JNK复合体的形成是IRE1α途径促进细胞凋亡的主要原因,WB结果也检测到IMB-6G对ASK1和JNK的激活作用。采用siRNA和抑制剂分别抑制ASK1和JNK的活性,均能部分减弱IMB-6G的促细胞凋亡作用。同时,XBP1作为IRE1α途径激活的特异剪接体,通过荧光显微镜观察到IMB-6G作用之后XBP1被切割激活。另外,我们未检测到IMB-6G对具有细胞保护作用的ATF6途径的影响。总之,我们的研究表明,槐定酸类衍生物IMB-6G通过激活内质网应激PERK和IRE1α两条途径促进肝癌细胞凋亡,并且它们分别介导的PERK-CHOP、IRE1α-ASK1-JNK两条信号通路的激活在细胞凋亡中发挥着重要作用。自噬是细胞的一种自我消化过程,将胞浆内容物包裹在双层膜结构中,然后运输到溶酶体中进行降解和再循环。自噬是肿瘤细胞抵抗应激的一种自我保护和生存机制,能够促进肿瘤的发生和药物抵抗,抑制其活性可能产生抗肿瘤活性。研究中发现,槐定酸类衍生物6b显示出良好的抗肿瘤活性,但6b是否通过自噬途径发挥其抗肿瘤活性还不明确。因此,本部分我们对6b的抗肿瘤作用与肿瘤细胞自噬的关系进行了研究。首先,通过GFP-LC3的聚集实验,发现6b能够引起LC3的点状聚集,同时通过WB实验,检测到LC3-Ⅱ蛋白水平也明显升高,但不能以此判断6b是否增强了细胞自噬水平。作为细胞中自噬活性的金标准,p62参与到细胞自噬的全过程,最终在溶酶体中被降解。实验中我们检测到化合物6b可以浓度依赖性和时间依赖性地升高p62的蛋白水平,初步说明6b抑制了细胞中的自噬活性。随后采用LC3 Turnover的实验方法,加入自噬抑制剂CQ和自噬增强剂Rapamycin。在合用CQ之后,没有检测到细胞中LC3-Ⅱ的进一步明显升高,说明LC3-Ⅱ被自噬溶酶体途径降解的很少。而合用Rapamycin后LC3-Ⅱ水平比单独的6b组有所升高,印证了化合物6b可能抑制了细胞中自噬体的降解。再者,我们采用mCherry-EGFP-LC3的双荧光表达质粒,利用GFP荧光在溶酶体酸性环境下不稳定易淬灭的特点,通过mCherry红色荧光和GFP绿色荧光表达的差异,判断自噬活性的变化。激光共聚焦的结果表明,6b作用之后,细胞中的红色荧光和绿色荧光点状聚集均出现增加,并且变化基本同步,说明细胞中的自噬体水平增加,但自噬溶酶体水平并没有增加。后期的实验中,我们采用溶酶体染料LysoTracker检测溶酶体的活性,在6b作用之后LysoTracker红色明显减弱,说明6b可能抑制了溶酶体的酸性,减弱了溶酶体的降解能力。与我们前期观察到的LC3-Ⅱ蛋白水平升高、p62蛋白水平升高的结果相吻合,同时荧光显微镜的结果也推测6b可能使溶酶体的活性受到抑制。以上研究结果表明,化合物6b可能通过抑制溶酶体的酸性,破坏了溶酶体的降解功能,影响了自噬作为细胞中小分子循环和能量供应的作用,从而抑制肿瘤细胞的增殖。我国属于肝癌高发地区,新发肝癌病例占全球的55%左右,且死亡人数占全球的51%。深入研究肝癌的发病机制有助于肝癌的及早发现与治疗。GSK-3β作为一种Ser/Thr激酶,参与到细胞周期、细胞分化、凋亡等众多生物过程中。同时多项研究表明,在多种肿瘤细胞中GSK-3β均表现出异常表达,但GSK-3β如何促进肝癌的发生发展还不清楚。我们的目标是阐明其在肝癌细胞中的作用。ASK1作为MAP3K家族的一个成员,属于细胞中的促凋亡因子之一,在ROS等应激反应中发挥着重要作用。实验中,使用H202作为刺激因子,选用人肝癌细胞HepG2和SMMC7721作为研究对象,首先通过流式细胞术检测到GSK-3β siRNA可以明显增强H202诱导的细胞死亡。同时,过表达GSK-3β可以显著减少H202引起的细胞死亡,初步证明了GSK-3β对肝癌细胞的保护作用。在真核生物中,Thr845位点的磷酸化对于ASK1的活性具有重要意义,我们在HepG2细胞中过表达野生型HA-GSK-3β WT和突变失活型 HA-GSK-3β K85A 质粒,WB 检测到 HA-GSK-3β WT 降低了 H202 诱导的 p-ASK1(Thr845)的蛋白水平,而失活的 HA-GSK-3β K85A 使 H202 诱导的 p-ASK1(Thr845)的蛋白水平升高。同样地,在HepG2细胞中沉默GSK-3β的表达后,也检测到p-ASK1(Thr845)的水平增加,再次证明了 GSK-3β对ASK1磷酸化的抑制作用。为了说明GSK-3β使ASK1磷酸化水平降低的原因,我们首先检测了 ASK1蛋白本底水平的变化,发现过表达GSK-3β可以降低ASK1蛋白的表达水平。随后,加入蛋白酶体抑制剂MG132和转录后抑制剂CHX,结果表明,当加入MG132之后,GSK-3β降低ASK1的作用受到了抑制。加入CHX后,过表达GSK-3β可以明显加速ASK1的降解速度。这些结果说明GSK-3β对ASK1的调控作用发生在转录后水平,并且ASK1的降解依赖蛋白酶体途径。而后,通过Ubiquitination实验,我们检测到HA-GSK-3βWT可以使ASK1的泛素化水平增加,而HA-GSK-3β K85A不影响ASK1的泛素化水平,这提示我们GSK-3β可能是通过调节ASK1的泛素化修饰,影响其降解过程。文献表明,Roquin-2和CHIP E3泛素连接酶和去泛素化酶USP9X可能参与ASK1的泛素化过程,我们通过siRNA和抑制剂的结合使用,证明了 GSK-3β通过USP9X影响ASK1的泛素化,而不依赖于E3连接酶Roquin-2和CHIP。总之,研究结果说明,在肝癌细胞中GSK-3β通过抑制去泛素化酶USP9X的作用,促进ASK1的泛素化途径降解,使ASK1的蛋白表达水平降低,从而发挥其促进肝癌细胞存活的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【相似文献】