基因甲基化模式改变在铝致认知功能障碍及脑内Aβ沉积中的机制研究

发布时间：2018-01-07 07:29

本文关键词：基因甲基化模式改变在铝致认知功能障碍及脑内Aβ沉积中的机制研究　出处：《山西医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分铝电解职业人群基因甲基化模式改变与Aβ的关系目的:通过铝电解职业人群现况研究检出MCI的患病情况,观察铝电解职业人群全基因组,与Aβ相关的特定基因(APP、BACE1、PS1)甲基化模式改变情况。方法:选取某铝厂电解车间工人366人,使用简短精神状态量表(MMSE)+画钟试验(CDT)筛取MCI人群,同时采集空腹抗凝血样,采用石墨炉原子吸收分光光度法检测血清铝水平;采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用ELISA法检测全基因组和血清Aβ的含量。同时应用多元线性回归和logistic回归分析等统计学方法探讨MMSE得分以及MCI检出率的影响因素,并探讨血铝内暴露水平、MMSE得分、与全基因组和特定基因甲基化水平(APP、BACE1、PS1)及Aβ表达的相关性。采用1:3病例对照研究,其中MCI为43人,非MCI为年龄、性别及工龄等相匹配的129人。分析铝暴露水平、全基因和特定基因甲基化以及Aβ表达的水平。结果:(1)铝电解职业人群血铝中值浓度为48.99μg/L(范围从6.63μg/L~158.8μg/L),并根据血铝内暴露水平25%和75%可信区间将铝作业工人分为三组:0-34.02μg/L组、34.03-61.42μg/L组和≥61.43μg/L组。(2)MMSE+CDT认知量表测试结果显示:不同血铝水平铝电解职业人群的MMSE总分随着血铝浓度的增加分别为28.3±1.3、27.8±1.9和27.1±1.8,不同血铝水平间差异具有统计学意义(P0.05);血铝≥61.4μg/L组在短时记忆、计算力和语言能力较0-34.02μg/L组和34.02-61.42μg/L组差异明显降低(P0.05),尤其是短时记忆力随着血铝浓度的增加,降低非常明显的。CDT测试结果显示:不同血铝水平铝电解职业人群的CDT分值随着血铝浓度的增加分别为3.73±0.96、3.38±1.02和2.41±0.49,三组间差异具有统计意义。(3)在366例铝电解工人中检出MCI为43例(11.7%),其中0-34.02μg/L组有4例(4.4%)、34.02-61.42μg/L组有16例(8.7%)、≥61.43μg/L组23例(25.3%),不同血铝水平MCI检出率差异有统计学意义(P0.01)。(4)应用多元线性回归法分析MMSE总分的主要影响因素是年龄、受教育程度、甘油三酯和血铝水平(P0.01)。(5)应用logistic回归分析铝电解职业人群MCI检出率与血铝显著相关(OR=2.57,OR的95%CI为1.50~4.41,P0.01),并且与年龄相关(OR=1.76,OR的95%CI为1.19~2.62,P0.05),同时与受教育程度也有关(OR=0.356,OR的95%CI为0.19~0.67,P0.05)。(6)随着血铝浓度的增加,铝电解职业人群全基因甲基化降低,三组间差异具有统计学意义(P0.05)。(7)甲基化特异性PCR法(MSP)检测结果提示:≥61.43组APP基因甲基化百分率(13.19%)低于0-34.02组(26.37%),差异有统计学意义(P0.01);同样,≥61.43组BACE1基因甲基化百分率(29.67%)低于低血铝组(40.66%),差异有统计学意义(P0.01),而PS1基因甲基化百分率有所降低,差异无统计学意义(P0.05)。(8)ELISA法检测血清Aβ的含量发现,34.03-61.42组、≥61.43μg/L组外周血淋巴细胞Aβ42含量明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。(9)采用1:3病例对照研究,其中MCI为43人,非MCI年龄、性别及工龄等相匹配的129人。①MCI的全基因甲基化水平为15.53%,非MCI全基因甲基化水平为17.54%,两者之间具有统计学意义(P0.05);②MCI组中发生APP甲基化的有6例,甲基化百分率为13.95%,而非MCI组中检出24例,APP甲基化百分率为18.60,两者之间有统计学意义(P0.05);③在MCI组中发生BACE1甲基化的为9例,百分率为20.93%,非MCI组检出37例,百分率为28.68%,二者之间有统计学意义(P0.05)。④MCI组PS1甲基化为16例,百分率为37.2%,非MCI组发生PS1甲基化为52例,百分率为40.31%,二者之间无统计学意义(P0.05)。⑤与非MCI组相比,MCI组外周血淋巴细胞Aβ42含量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:铝电解职业人群现况研究结果提示,长期铝暴露可能是引起认知功能障碍(MCI),进而发展为阿尔茨海默病(AD)的发病危险因素之一,当铝电解职业人群全基因低甲基化,特定基因APP和BACE1低甲基化时,发生MCI的危险性可能增大。同时提示基因甲基化可能参与了铝致认知功能损害的过程,并且通过早期血液指标的检测可能反应出脑组织的变化情况。第二部分阿尔茨海默病人群基因甲基化模式改变与Aβ的关系目的:通过对阿尔茨海默病(AD)人群现况研究,观察AD人群全基因组,与Aβ相关的特定基因(APP、BACE1、PS1)甲基化模式改变情况。方法:使用简易精神状态量表(MMSE)和临床痴呆评定量表(CDR)来评价AD人群的认知水平及认知损害程度,从中选取轻度认知功能障碍组(MCI)50人,轻度AD组50人、中度AD组50人以及重度AD组50人。同时选择年龄、性别和受教育程度相匹配的正常对照人群100人。采用石墨炉原子吸收分光光度法检测血清铝水平;采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用ELISA法检测血清Aβ的含量,分析AD人群血铝水平、全基因组和特定基因甲基化水平以及Aβ表达水平。结果:(1)对照组血铝中值浓度为33.1μg/L(范围从6.9μg/L~58.8μg/L)。AD人群血铝中值浓度为43.5μg/L(范围从7.9μg/L~65.3μg/L),AD人群血铝水平较对照组有明显差别的(P0.05)。(2)MMSE认知量表测试结果显示:对照组的MMSE总分为28.3±1.3,MCI组为24.6±2.4两组之间差异具有统计学意义(P0.05)。各AD组随着病情的加重,MMSE总分值降低,分别为22.1±1.9、16.7±2.8和5.8±9.4,与对照组比较具有统计学意义(P0.05),并与MCI组比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。(3)AD患者MMSE问卷得分主要与性别、年龄、文化程度和血铝水平有线性回归关系(P0.01),其中与性别呈负相关。(4)对照组全基因甲基化百分率为19.57%,MCI组全基因甲基化百分率为15.15%;轻度、中度和重度AD组全基因甲基化百分率为14.19%、13.50%和11.17%;与对照组比较,MCI组和轻度、中度、重度AD组全基因组甲基化水平降低,具有统计学意义(P0.05);与MCI组比较,中度、重度AD组全基因组甲基化水平降低明显,具有统计学意义(P0.05)。(5)甲基化特异性PCR法(MSP)检测结果显示:①对照组APP甲基化百分率(32%),随着认知损害程度的加重,MCI组和轻度、中度、重度AD组APP甲基化的百分率是降低的,差异有统计学意义(P0.01);与MCI组甲基化百分率(26%)进行比较,轻度、中度、重度AD组的APP异常甲基化的百分率降低明显,差异有统计学意义(P0.05);②对照组BACE1甲基化百分率(37%),随着AD病情的加重,轻度、中度、重度BACE1甲基化的百分率是降低的,差异有统计学意义(P0.01);③阿尔茨海默病人群PS1异常甲基化的百分率,与对照组甲基化百分率(34%)进行比较,PS1基因甲基化的百分率无降低趋势,差异无统计学意义(P0.05);与MCI组甲基化百分率(48%)进行比较,轻度AD组和重度AD组的PS1异常甲基化的百分率降低,差异有统计学意义(P0.05)。(6)ELISA法检测血清Aβ的含量发现,与对照组相比,MCI组和轻度、中度、重度AD组外周血淋巴细胞Aβ42含量明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。与MCI组比较,轻度、中度、重度AD组外周血淋巴细胞Aβ42含量增加明显,有统计学意义(P0.05)。结论:AD人群现况研究结果提示,高龄、女性、文化水平低和血铝水平高可能是AD的高危因素;AD人群的全基因低甲基化,特定基因APP和BACE1也发生低甲基化,低甲基化的基因可增强基因表达或过表达,导致AD外周血Aβ的表达量增高,这与本次铝电解车间工人的研究结果相一致。铝电解职业人群的基因甲基化模式改变与AD一致,提示铝电解职业人群可能存在和AD人群一样的DNA甲基化模式。进一步证实DNA甲基化参与了铝致Aβ沉积相关基因表达的调控,这为完善铝导致认知功能障碍、甚至AD的表观遗传学机制提供科学依据。第三部分基因甲基化模式改变在铝致大鼠脑内Aβ沉积的作用机制研究目的:探讨麦芽酚铝Al(mal)3对大鼠学习记忆能力的影响及其与脑组织Aβ蛋白沉积相关基因的甲基化模式改变情况。方法:大鼠采用腹腔注射Al(mal)3进行染毒,将40只SD大鼠按体重随机分成4组,生理盐水组,10μM/kg、20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3组,每组10只。每天腹腔注射0.1m L/100g,浓度为40mmol/L的Al(mal)3进行染毒,对照组给予等量生理盐水,连续5天,休息2天,共8周。采用水迷宫实验检测大鼠的认知功能;处死大鼠取空腹抗凝血样和脑组织,分别按照以下方法检测血、脑组织中各项指标。采用石墨炉原子吸收分光光度法检测血清铝和脑铝水平;测定全基因组和APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用q RT-PCR检测APP、BACE1和PS1的m RNA表达水平;采用ELISA法检测APP、BACE1、PS1和Aβ蛋白的表达水平。结果:(1)水迷宫大鼠行为学检测结果提示:在同一天中,各染毒组大鼠的逃避潜伏期较对照组延长,但差异无统计学意义(P0.05)。而铝各剂量染毒组大鼠的目标象限停留时间与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,20μM/kg Al(mal)3、40μM/kg Al(mal)3组大鼠穿越平台位置次数差异有统计学意义(P0.05)。(2)各组大鼠血铝及海马铝检测结果示,与生理盐水组比,各剂量Al(mal)3染毒组大鼠的血铝含量差异有统计学意义(P0.05)。随染毒剂量的增加大鼠的脑铝含量逐渐增多,与生理盐水组比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3组大鼠的脑铝含量差异有统计学意义(P0.05)。(3)随Al(mal)3染毒剂量的增加大鼠外周血和海马全基因组甲基化率降低,与生理盐水组比,20μM/kg Al(mal)3组、40μM/kg Al(mal)3组的大鼠的全基因组甲基化率差异有统计学意义(P0.05)。(4)甲基化特异性PCR法(MSP)检测结果提示:APP、BACE1基因甲基化水平是降低的,而PS1基因甲基化水平较生理盐水组未见明显变化,并且血和海马中的变化一致。(5)RT-PCR结果,20μM/kg Al(mal)3组、40μM/kg Al(mal)3组的海马APP、BACE1和PS1基因m RNA的表达水平与生理盐水组比,差异有统计学意义(P0.05);20μM/kg Al(mal)3组、40μM/kg Al(mal)3组大鼠外周血APP、BACE1基因m RNA的表达水平与生理盐水组比,差异有统计学意义(P0.05),而外周血PS1基因m RNA的表达水平仅40μM/kg Al(mal)3组有统计学意义(P0.05)。(6)ELISA法检测外周血和海马APP、BACE1、PS1和Aβ的含量发现:①随Al(mal)3染毒剂量的增加大鼠外周血、海马中APP蛋白浓度逐渐增加,与生理盐水组比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3组APP蛋白浓度有统计学意义(P0.05)。②大鼠外周血、海马PS1蛋白浓度随Al(mal)3染毒剂量的增加逐渐增加,与生理盐水组比,40μM/kg Al(mal)3组PS1蛋白浓度差异有统计学意义(P0.05)。③大鼠外周血、海马中BACE1结果,与生理盐水组相比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3组的大鼠海马中BACE1蛋白浓度差异有统计学意义(P0.05)。④与生理盐水组比,各剂量Al(mal)3染毒组大鼠外周血、海马Aβ42蛋白浓度差异有统计学意义(P0.05)。结论：动物实验观察铝致Aβ沉积相关基因甲基化模式改变情况,以及铝对特定基因(APP、PS1、BACE1)的m RNA、蛋白和Aβ表达水平的影响,并尝试将全基因、APP和BACE1基因甲基化作为铝致神经毒性的生物标志物,进而完善铝神经毒性的作用机制,为铝毒性从DNA水平进行预防及治疗提供新的思路和理论基础。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R135

【参考文献】