AXL在非小细胞肺癌中的作用及与EGFR信号通路相关性研究

发布时间：2018-01-09 22:24

本文关键词：AXL在非小细胞肺癌中的作用及与EGFR信号通路相关性研究　出处：《河北医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国以及世界范围内,肺癌的发病率及死亡率均位于常见恶性肿瘤的前列。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)为肺癌最常见的组织学类型,主要包括鳞癌和腺癌。近年来,表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)在特定位点突变NSCLC治疗中的疗效值得肯定,但随之出现的耐药问题已经成为NSCLC分子靶向治疗的严峻挑战。针对EGFR-TKI治疗的耐药机制包括原发耐药和继发耐药两种,揭示相关耐药机制对于肺癌患者的有效治疗是十分必要和迫切的问题。AXL属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族,又称TAM家族,主要包括AXL、Tyro3(Sky)和Mer。从第一次在慢性粒细胞白血病患者中分离获得后,AXL已被发现在人类多种细胞中呈现过表达。近来,在多种类型的肿瘤研究中,AXL被视为调节常规治疗和肿瘤靶向治疗耐药的研究焦点。在NSCLC的治疗中,有研究通过对EGFR-TKI产生继发耐药患者肿瘤组织的二次活检,发现AXL高表达为第二大耐药分子标记。此外,AXL基础表达也与EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKI的原发耐药有关。因此,深入了解AXL在NSCLC对EGFR-TKI继发及原发耐药中的作用机制具有重要临床意义。然而,NSCLC组织中AXL和EGFR两个受体激酶之间表达的相关性、以及AXL表达与EGFR突变状态的关系、抑制AXL表达能否提高NSCLC细胞(EGFR野生型)对药物的敏感性等问题,目前尚不清楚。鉴于此,本研究第一部分利用肺腺癌患者手术切除石蜡组织作为研究对象,通过检测组织中EGFR突变(19外显子缺失及21外显子L858R)、AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白表达,分析AXL与EGFR通路在原发肺腺癌组织中的相关性;第二部分以NSCLC细胞株—A549及H1299为研究对象,从细胞增殖、细胞周期及凋亡、细胞迁移能力等方面,检测AXL在细胞中的生物学作用,同时观察AXL对EGFR下游信号通路AKT及ERK的影响。第三部分进一步探讨AXL在A549及H1299细胞对化疗及靶向治疗药物反应中的作用。第一部分膜受体激酶AXL与EGFR通路在原发肺腺癌组织中表达的相关分析目的:检测EGFR基因19外显子缺失、21外显子L858R点突变及20外显子T790M在肺腺癌组织中的突变情况;检测AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白在肺腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性;进一步分析AXL与EGFR、pEGFR1068在EGFR突变及野生型病例中的共表达情况。方法:1.病例信息共收集术前未经放疗或化疗的原发肺腺癌患者手术切除标本109例,标本经10%中性福尔马林固定液固定,石蜡包埋切片备用。2.基因组DNA提取应用TIANamp FFPE DNA试剂盒,按照试剂盒说明提取109例石蜡切片组织中的基因组DNA。3 PCR结合测序方法检测EGFR19和21外显子突变采用巢式PCR方法扩增EGFR 19、21外显子,产物经ABI 3730XL DNA分析仪进行Sanger序列分析。本部分由Invitrogen公司提供服务(合同号MB140120001B)。4 ARMS PCR(amplification refractory mutation specific PCR)采用人类EGFR基因突变检测试剂盒(ADx-EG10,Amoy Diagnostics Co.,LTD,China)对109例肺癌组织EGFR突变进行检测。共检测EGFR基因4种突变,包括:Ex19-mutant-1:E746_A750del(2235-2249 del15)、Ex19-mutant-2:E746_A750del(2236-2250 del15)、Ex21-mutant-1:L858R(2573TG)以及Ex20-mutant-1:T790M(2369CT)。5.免疫组织化学方法采用免疫组织化学染色方法,检测109例肺腺癌患者肿瘤组织石蜡包埋切片中AXL、EGFR和pEGFR1068的表达情况,并分析其表达与临床病理特征的关系。6.统计分析应用卡方检验检验肺腺癌组织中AXL、EGFR和pEGFR1068表达及与临床病理特征的相关性。应用Spearman相关分析方法评估突变组与野生组之间的关系。结果:1 109例人肺腺癌病例中EGFR突变检测1.1 PCR结合直接测序法109例病例中,19外显子缺失病例为25例(22.9%),E746-A750del是最常见的类型(13/25,52.0%)。21外显子L858R点突变阳性者为22例(20.2%)。综上,PCR直接测序法共检测到19Del或21 L858R阳性者47例,阴性62例,总体突变率为43.1%(47/109)。1.2 ARMS方法为了避免出现假阴性结果,进一步利用ARMS方法对PCR-直接测序检测为阴性的62例进行检测。结果表明,有21例(33.9%)为EGFR突变阳性。综合PCR直接测序结果和ARMS检测结果,109例肺腺癌患者中携带EGFR19del、21 L858R常见突变的发生率为62.4%(68/109)。此外,在109例病例中只有2例(1.83%)出现T790M突变。2 AXL、EGFR和pEGFR1068在人肺腺癌中的表达及与临床病理特征的相关分析:2.1 AXL蛋白表达免疫组化检测结果表明,109例肺腺癌组织中,AXL蛋白的阳性表达率为55.0%(60/109),其表达与淋巴转移显著相关(P=0.035),但AXL表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、腺癌亚型等均无相关性。2.2 EGFR蛋白表达109例肺腺癌组织中EGFR蛋白的阳性表达率为62.4%(68/109),结合患者临床病理特征分析发现,EGFR表达与腺癌亚型(P=0.02)、肿瘤大小(P0.001)、以及远处转移(P=0.007)相关,而与患者年龄、性别、TNM分期等无显著相关性。2.3 pEGFR1068表达109例肺腺癌组织中pEGFR1068蛋白的阳性表达率为52.3%(57/109)。在肿瘤直径3cm的病例中,pEGFR1068表达量明显高于直径≤3cm者(P0.001);在淋巴结转移组病例中,pEGFR1068表达量明显高于无淋巴结转移组(P0.001)。3 AXL、EGFR/pEGFR1068表达与EGFR19 del和(或)L858R突变状态的相关性:109例患者中,单独出现EGFR19 del突变者共32例,19 del阴性者77例;单独出现L858R突变者共34例,L858R突变阴性者75例;表现为19 del或L858R突变者共68例,阴性者41例。3.1 AXL表达与突变的相关性:统计分析表明,AXL表达与单独携带19 del突变无统计意义(P=0.05),AXL表达与单独L858R突变、19 del/L858R突变状态无相关性(P0.05)。3.2 EGFR蛋白表达与突变的相关性:在单独携带L858R突变的病例中EGFR蛋白表达率(76.5%,26/34)显著高于L858R阴性组(56.0%,42/75;P=0.04)。EGFR蛋白表达与单独19 del、19 del/L858R突变状态无相关性。3.3 pEGFR1068表达与突变的相关性:在34例单独携带L858R突变的病例中,pEGFR1068的阳性表达率为73.5%(25/34),显著高于L858R阴性病例(42.7%,P=0.003)。在68例19 Del/L858R突变者中,pEGFR1068的阳性表达率显著高于突变阴性组(60.3%v.s.14.6%,P=0.031)。4 AXL与EGFR/pEGFR1068共表达情况检测去除2例T790M突变病例,在剩余的107例肺腺癌患者中,37例显示AXL和EGFR共表达,30例患者显示AXL和pEGFR1068共表达,25例患者显示AXL,EGFR和pEGFR1068共表达。进一步分析表明AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表达百分率在EGFR突变患者显著高于EGFR野生型患者(30.9%vs.10.3%,P=0.015)。小结:1 109例肺腺癌病例中EGFR 19外显子缺失突变、21外显子L858R突变的发生率较高,达到62.4%,而20外显子T790M原发突变仅为1.83%。2 AXL蛋白表达在淋巴结转移组病例中显著高于无淋巴结转移组;EGFR蛋白表达与腺癌亚型、肿瘤大小及远处转移相关;pEGFR1068蛋白表达与肿瘤大小及淋巴结转移显著相关。3 AXL表达与EGFR突变状态间无显著相关性;EGFR、pEGFR1068表达与EGFR21外显子L858R点突变显著相关,而且pEGFR1068在携带19 Del或L858R突变患者表达显著增加,提示EGFR Tyr-1068位点磷酸化与EGFR敏感突变有关。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表达率在EGFR突变组显著高于野生型肺腺癌患者。结果提示,对于AXL与EGFR信号通路共同激活的病例,联合应用AXL抑制剂与EGFR抑制剂,将有利于改善对EGFR靶向治疗的原发或继发耐药作用。第二部分AXL在非小细胞肺癌细胞中生物学效应的体外实验研究目的:本研究以非小细胞肺癌A549、H1299细胞株为模型,利用siRNA干扰技术及AXL激酶抑制剂R428抑制AXL表达及活性,从细胞增殖、细胞周期与凋亡、细胞迁移能力、以及相关信号通路等方面,探讨AXL在肺癌中的生物学效应,同时初步观察抑制AXL表达对EGFR信号通路下游分子ERK/p-ERK、AKT/p-AKT表达的可能作用。方法:1细胞培养及处理人NSCLC细胞株-A549及H1299,培养于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素的RPMI-1640培养基,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长,常规传代。2 R428处理细胞按2×104/m L密度接种细胞于96孔板中,贴壁后更换含1%血清的RPMI-1640培养基饥饿细胞24h后,加入不同浓度梯度的R428作用24h,计算半数抑制浓度(IC50)值。3 siRNA细胞转染用100 pmol Negtive control siRNA(NC siRNA)、AXL特异性siRNA转染H1299和A549细胞,收集细胞用于后续实验。4 MTT检测2×104个/孔细胞均匀接种于96孔板中,贴壁12小时后转染细胞或给予R428处理,MTT比色法计算细胞存活率。5 Real-time PCR提取细胞总RNA,应用Real-time PCR方法,检测细胞中AXL m RNA表达。参照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法计算目的基因的相对表达量。6蛋白免疫印迹(Western blot)转染至48小时前两小时加入或不加EGF刺激2小时,提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法检测细胞中AXL、EGFR/pEGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT在蛋白水平的表达情况。7 FCM检测细胞周期分布分别收集NC siRNA或AXL siRNA转染组细胞、对照组与R428处理组细胞,0.25%胰蛋白酶消化吹打制备单细胞悬液,70%乙醇4℃固定过夜。PI避光染色30min,1h内上机检测,应用Flow Jo 7.6软件进行数据分析。每组实验重复三次。8 FCM检测细胞凋亡分别收集NC siRNA或AXL siRNA转染组细胞、对照组与R428处理组细胞,采用Annexin-V/PI试剂盒,通过流式细胞仪检测各组细胞在A或D状态下的凋亡情况,应用Flow Jo 7.6软件进行数据分析。9 Transwell小室实验各组细胞以2×104个接种于小室上层,于接种后不同时间,固定染色后于显微镜下观察下室细胞的迁移情况。倒置显微镜下任取10个视野,计数穿膜细胞的平均值。每组实验重复三次。10细胞划痕实验分别于划痕后0-48h观察各组细胞在划线两侧的生长情况,于显微镜下观察并拍照,每组实验重复三次。11统计分析应用SPSS Statistics19.0软件,数据分析采用两样本t检验、χ2检验、及直线拟合;计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。P0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 AXL siRNA干扰对A549和H1299细胞的生物学作用1.1 AXL siRNA干扰效率检测A549和H1299细胞转染AXL siRNA后,Western Blot和q PCR检测结果表明,三个siRNA序列均可显著抑制AXL在蛋白和m RNA水平的表达,我们选择了其中的一个siRNA1(AXL siRNA)进行后续实验。1.2 AXL siRNA干扰对细胞生长的影响与阴性对照组相比,AXL siRNA转染抑制AXL表达可显著降低A549细胞和H1299细胞的存活率(P0.05)。1.3 AXL siRNA干扰对细胞周期的影响A549细胞AXL siRNA转染组G0/G1期比例为(86.10±0.10)%,显著高于阴性对照组(74.15±0.25)%。而S期、G2M期细胞比例则显著低于对照组(P0.05)。但siRNA转染敲低AXL表达对H1299细胞周期无明显改变。1.4 AXL siRNA转染对细胞凋亡的影响与阴性对照组相比,AXL siRNA转染组A549细胞总凋亡率有所增加,但无统计学意义。H1299细胞AXL siRNA转染后细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05)。1.5 AXL siRNA转染对细胞迁移能力的影响Transwell小室检测结果表明,在AXL siRNA转染的A549细胞和H1299细胞组穿过膜的细胞数目明显低于各自的对照组(P0.05)。此外,细胞划痕实验结果表明,划痕后48h可见:AXL siRNA转染组A549细胞划痕愈合面积(27.43±0.01%)明显低于对照组(85.67±0.02%),差异有统计学意义(P0.05)。同样,在AXL siRNA转染的H1299细胞组细胞朝向划痕的愈合面积明显低于对照组细胞(P0.05)。综合上述结果表明,抑制AXL表达可降低A549细胞、H1299细胞的迁移能力。2特异性AXL激酶抑制剂—R428对A549和H1299细胞的生物学作用2.1 R428对细胞生长的影响MTT结果表明,随R428处理浓度增加,两种细胞存活率逐渐降低。经统计分析表明,A549、H1299细胞中R428的IC50值分别为28.98n M、34.71n M。后续实验我们选择R428的使用浓度为20n M。2.2 R428对细胞周期的影响20n M R428作用24小时,与对照组相比,R428处理组A549细胞G0/G1期比例显著增加(R428:(88.37±0.15)%;对照组:(68.60±0.20)%),而S期、G2/M细胞比例显著降低(P0.05)。此外,R428处理组H1299细胞周期分布变化与A549变化一致。结果表明20n M R428处理可引起A549和H1299细胞G0/G1期阻滞。2.3 R428对细胞凋亡的影响与对照组相比,R428处理组A549细胞总凋亡率无明显改变,但是20n M R428处理可引起H1299细胞凋亡率明显增高(P0.05)。2.4 R428对细胞迁移能力的影响Transwell小室检测结果表明,R428处理可显著抑制A549细胞和H1299细胞穿过膜的细胞数目(P0.05)。划痕48h实验结果显示,R428处理组A549细胞划痕愈合面积(15.78±0.01%)明显低于对照组(92.45±0.10%),差异有统计学意义(P0.05)。此外,R428处理组H1299细胞划痕愈合面积显著低于对照组。3抑制AXL表达对细胞ERK/p-ERK、AKT/p-AKT水平的影响细胞分为4组:NC siRNA、AXL siRNA、NC siRNA+EGF、AXL siRNA+EGF组。蛋白印迹结果表明,AXL siRNA转染组A549细胞、H1299细胞中p-AKT的水平显著低于对照组,但是EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK的水平变化不明显。给予细胞EGFR受体的配体—EGF刺激后,细胞中p-EGFR水平显著增高,证实EGFR通路被激活。同时EGFR下游p-ERK及p-AKT的水平也不同程度升高。但与EGF+NC siRNA处理组相比,AXL siRNA转染联合EGF刺激后,两种细胞中p-AKT的水平显著被抑制。结果提示:AXL表达对EGFR下游通路p-AKT的活化具有一定的激活作用,AXL与EGFR通路间存在一定的交叉作用。小结:1 转染AXL siRNA敲低A549、H1299细胞中AXL在m RNA及蛋白水平表达,可显著抑制两种细胞的增殖活性,其机制与细胞发生G0/G1期阻滞或促进细胞凋亡有关。2 20n M AXL激酶抑制剂-R428处理A549、H1299细胞,可引起两种细胞发生G0/G1期阻滞,显著抑制细胞的增殖活性。3 AXL siRNA转染或R428处理可显著抑制A549细胞及H1299细胞迁移能力。4 转染AXL siRNA敲低AXL表达,可显著抑制A549及H1299细胞中p-AKT的水平。p-AKT作为AXL与EGFR共同的下游信号分子,AXL对p-AKT的调节可能是AXL激酶与EGFR下游通路的交叉点。第三部分AXL在NSCLC细胞对gefitinib及docetaxel药物反应中的作用目的:通过siRNA干扰技术敲低A549及H1299细胞中AXL表达,或给予AXL激酶抑制剂—R428抑制其激酶活性,观察细胞对gefitinib及docetaxel反应性的影响。此外,从细胞周期分布及细胞凋亡两方面,初步分析AXL在细胞对药物反应中的可能作用机制。方法:1细胞培养及转染人NSCLC细胞株A549及H1299细胞株,培养条件及siRNA转染条件同第二部分。2 siRNA细胞转染联合药物处理细胞及分组2.1转染联合gefitinib将细胞分为Negative control siRNA(NC组)、AXL siRNA、NC+gefitinib、AXLsiRNA+gefitinib四组。按照上述方法培养并转染细胞,转染后24小时加入gefitinib使终浓度为10n M,继续作用24小时收取细胞进行相关实验。2.2转染联合Docetaxel将细胞分为Negative control siRNA(NC组)、AXL siRNA、NC+Docetaxel、AXLsiRNA+Docetaxel四组。按照上述方法培养并转染细胞,转染后24小时加入Docetaxel使终浓度为20n M,继续作用24小时收取细胞进行相关实验。3 R428联合药物处理细胞及分组3.1 R428联合gefitinib将细胞分为对照组、R428处理组、gefitinib(10n M)、R428联合gefitinib四组。按2×104/m L密度将细胞均匀接种于6孔板中,贴壁后换成含1%血清的RPMI 1640培养基饥饿细胞24h后,加入R428和或gefitinib作用24h收集各组细胞进行后续检测。3.2 R428联合Docetaxel将细胞分为对照组、R428处理组、docetaxel(20n M)、R428联合docetaxel(20n M)四组。按2×104/m L密度将细胞均匀接种于6孔板中,贴壁后换成含1%血清的RPMI 1640培养基饥饿细胞24h后,加入R428和或docetaxel作用24h收集各组细胞进行后续检测。4 MTT检测2×104个/孔细胞均匀接种于96孔板中,贴壁12小时后,按上述分组经不同处理措施后,MTT比色法计算细胞存活率。5 FCM检测细胞周期分布分别收集不同处理组细胞,备单细胞悬液,70%乙醇4℃固定过夜。PI避光染色30min,1h内上机检测,应用Flow Jo 7.6软件进行数据分析。每组实验重复三次。6 FCM检测细胞凋亡分别收集不同处理组细胞,采用Annexin-V/PI试剂盒,通过流式细胞仪检测各组细胞在A或D状态下的凋亡情况,应用Flow Jo 7.6软件进行数据分析。7统计分析所有数据应用SPSS Statistics19.0软件,数据分析采用方差分析或T检验;计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。P0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 AXL siRNA干扰联合gefitinib对A549与H1299细胞生长的影响及机制探讨1.1 MTT检测在A549与H1299细胞中,与NC组相比,AXL siRNA干扰组、NC+gefitinib组及AXL siRNA+gefitinib组细胞存活率均显著降低(P0.05)。与AXL siRNA干扰组、NC+gefitinib组相比,AXL siRNA+gefitinib组细胞存活率显著降低(P0.05)。1.2 FCM检测细胞周期分布在A549与H1299细胞中,与NC组相比,仅AXL siRNA+gefitinib组细胞G0/G1期比例显著增多,而G2/M期以及S期细胞比例显著减少(P0.05);NC+gefitinib处理对细胞周期无显著影响。组间比较:AXL siRNA+gefitinib组细胞G0/G1期比例虽显著高于NC+gefitinib组(P0.05)。1.3 FCM检测细胞凋亡在A549与H1299细胞中,与NC组相比,NC+gefitinib组及AXL siRNA+gefitinib组细胞凋亡率均显著升高(P0.05)。组间比较,AXL siRNA+gefitinib组细胞凋亡率显著高于AXL siRNA组及NC+gefitinib组(P0.05)。2.R428联合gefitinib对A549与H1299细胞生长的影响及机制探讨2.1 MTT检测在A549与H1299细胞中,与对照组相比,R428处理组、gefitinib组以及R428联合gefitinib组细胞存活率均明显被抑制(P0.05)。组间比较:R428联合gefitinib组细胞存活率最低,明显低于gefitinib组和R428干预组(P0.05)。2.2 FCM检测细胞周期分布在A549与H1299细胞中,与对照组相比,R428处理组、R428联合gefitinib组细胞G0/G1期比例显著增多,G2/M期、S其细胞比例相应减少(P0.05)。组间比较:R428联合gefitinib组细胞G0/G1期比例虽显著高于gefitinib组(P0.05)。2.3 FCM检测细胞凋亡在A549与H1299细胞中,与对照组相比,gefitinib处理组、R428联合gefitinib组细胞凋亡率显著增加(P0.05)。组间比较:R428联合gefitinib处理组细胞凋亡率较R428处理组、gefitinib处理组均显著增加(P0.05)。3.AXL siRNA干扰联合Docetaxel对A549和H1299细胞生长的影响及机制探讨:3.1 MTT检测在A549与H1299细胞中,与NC相比,AXL siRNA干扰组、NC+docetaxel组及AXL siRNA+docetaxel组细胞存活率均出现不同程度降低(P0.05)。组间比较:在A549细胞中AXL siRNA+docetaxel组细胞存活率低于NC+docetaxel组与AXL siRNA干扰组(P0.05)。在H1299细胞中,联合用药组与单独处理组均无显著差异。3.2 FCM检测细胞周期分布在A549与H1299细胞中,与NC组相比,NC+docetaxel组细胞处于G2/M期比例显著增加G0/G1期细胞比例则显著降低提示docetaxel可引起细胞发生G2/M期周期阻滞。组间比较:与NC+docetaxel相比,在A549细胞中AXL siRNA+docetaxel处理组细胞G2/M期比例显著降低,而G0/G1期细胞则显著增加(P0.05)。在H1299细胞中,NC+docetaxel与AXL siRNA+docetaxel组相比,各期细胞比例无显著差异(P0.05)。3.3 FCM检测细胞凋亡在A549与H1299细胞中,与NC组相比,NC+docetaxel组及AXL siRNA+docetaxel组细胞凋亡率均显著升高(P0.05)。组间比较:AXL siRNA+docetaxel组细胞凋亡率显著高于AXL siRNA组(P0.05)。4 R428联合docetaxel对A549和H1299细胞生长的影响及机制探讨:4.1 MTT检测:在A549和H1299细胞中,与对照组相比,R428处理组、docetaxel处理组、R428联合docetaxel处理组细胞活存率均降低(P0.05)。组间比较:R428联合docetaxel组细胞存活率最低,显著低于docetaxel组和R428处理组(P0.05)。4.2 FCM检测细胞周期分布在A549和H1299细胞中,与对照组相比,docetaxel处理组细胞处于G2/M期比例显著增加G0/G1期细胞比例则显著降低(P0.05);R428处理组细胞G0/G1期比例显著增多,G2/M期、S期细胞比例相应减少(P0.05)。组间比较:与单独docetaxel组相比,R428联合docetaxel处理组细胞G2/M期比例显著降低,而G0/G1期细胞则相应显著增加(P0.05)。4.3 FCM检测细胞凋亡在A549和H1299细胞中,与对照组相比,docetaxel组及R428联合docetaxel处理组细胞凋亡率均显著升高(P0.05)。组间比较:R428联合docetaxel处理组细胞凋亡率显著高于R428处理组(P0.05)。小结:1 Gefitinib处理A549与H1299细胞,对细胞周期影响不显著,但可促进细胞凋亡,从而抑制细胞的增殖活性。2 Docetaxel处理A549与H1299细胞,可引起明显的G2/M期周期阻滞,发挥其对细胞生长的抑制作用。3 AXL siRNA转染/R428联合gefitinib处理,对A549与H1299细胞生长的抑制作用高于单独处理组,其对生长的抑制与引起细胞G0/G1阻滞或促进凋亡相关。4 R428联合docetaxel处理对A549与H1299细胞生长的抑制作用高于单独处理组,其抑制作用与引起细胞G0/G1、G2/M期细胞周期阻滞或促进凋亡相关。结论:1 109例肺腺癌组织中,EGFR 19外显子缺失突变、21外显子L858R突变的发生率较高(62.4%),而20外显子T790M原发突变仅为1.83%。2 109例肺腺癌病例中,AXL蛋白表达在淋巴结转移组病例中显著高于无淋巴结转移组;EGFR蛋白表达与腺癌亚型、肿瘤大小及远处转移相关;pEGFR1068蛋白表达与肿瘤大小及淋巴结转移显著相关。3 AXL表达与EGFR突变状态间无显著相关性;EGFR、pEGFR1068表达与EGFR21外显子L858R点突变显著相关,而且pEGFR1068在携带19 Del或L858R突变患者表达显著增加,提示EGFR Tyr-1068位点磷酸化与EGFR敏感突变有关。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表达率在EGFR突变组显著高于野生型肺腺癌患者,表明在部分原发肺腺癌病例中AXL与EGFR通路间存在共表达情况。体外实验进一步表明,p-AKT作为AXL与EGFR共同的下游信号分子,AXL对p-AKT的调节可能是AXL激酶与EGFR下游通路的交叉点之一。5 转染AXL siRNA或给予20n M AXL激酶抑制剂-R428处理A549与H1299细胞,可显著抑制细胞的增殖活性,其机制与细胞发生G0/G1期阻滞或促进细胞凋亡有关。同时,抑制AXL可显著降低细胞的迁移能力。6 Gefitinib或docetaxel单独处理A549与H1299细胞,可显著抑制细胞的生长。其中gefitinib可促进细胞凋亡从而抑制细胞的增殖活性,而docetaxel可引起明显的G2/M期周期阻滞,发挥其对细胞生长的抑制作用。7 AXL siRNA转染/R428联合gefitinib或docetaxel处理,对A549与H1299细胞生长的抑制作用高于单独处理组,其对生长的抑制与引起细胞G0/G1、G2/M阻滞或促进凋亡相关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】