血源性人细小病毒核酸检测体系建立与人细小病毒B19分子特性分析

发布时间：2018-01-09 18:28

本文关键词：血源性人细小病毒核酸检测体系建立与人细小病毒B19分子特性分析　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：血液制品的病毒安全性一直是倍受关注的热点问题。随着输血传播病毒筛查技术以及病毒灭活/去除技术的发展应用,人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)等对血液制品安全的威胁已极大降低。人细小病毒B19(human parvovirus B19,B19病毒)和人细小病毒4(human parvovirus4,PARV4)成为了新的威胁血液制品安全性的病原体,近年来日益引起人们的关注。为降低B19病毒经血液制品传播的潜在风险,国际组织及发达国家均采取了一系列监控措施,建议/要求在血液制品生产过程中使用B19病毒核酸扩增检测技术(nucleic acid amplification technology,NAT)作为在线控制措施,保证用于血液制品生产的混合原料血浆中B19病毒载量不高于104 IU/m L。PARV4因其生物学特性、理化特性等与B19病毒高度相似而引起关注,其也有可能通过血液制品输注途径传播,但国外尚未制定相关监控措施及标准。我国目前对于原料血浆中细小病毒的监控尚无任何相关文件和技术指导原则,对于献血/献浆人群中细小病毒的携带情况以及原料血浆中的污染状况缺乏足够的基础性数据,也没有对国内现有毒株特性进行系统分析。根据以上研究背景,结合我国实际情况,本研究主要进行了以下几方面工作:(1)人细小病毒B19通用核酸检测体系中竞争性内标的优化与评价在前期建立的基于实时荧光定量PCR技术(fluorescence-based quantitative real-time PCR,qPCR)的B19病毒通用核酸检测体系基础上,对竞争性内标的构建方法进行优化。将竞争性内标的扩增片段克隆到M13mp18噬菌体载体中,转染XL1-Blue感受态细胞获得了噬菌体蛋白包裹单链DNA的竞争性噬菌体内标M13mp18-IC,并确定了该内标在血浆样品中的最佳添加浓度为10 copies/μL。最后对添加内标的B19病毒检测体系分别进行了敏感性、特异性、重复性和准确性评价。结果显示,B19病毒通用核酸检测体系的定量下限可达10 copies/μL,即可对病毒载量低至492 IU/mL的血浆中B19病毒核酸进行准确定量;与其他经血传播病毒均无交叉反应;5×107~5×101 copies/μL浓度范围内,B19病毒参考品质粒在批内和批间重复实验中各浓度质粒的Cq值变异系数均小于2%,批内和批间实验中,各浓度B19病毒参考品质粒的拷贝数平均变异系数分别为8.60%和9.17%;1×108~1×104 copies/μL浓度范围内,B19病毒通用核酸检测体系具有高度准确性(斜率=1.005)。本研究建立的B19病毒通用核酸检测体系,既有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所导致的假阴性检测结果,可用于将来对血液制品生产用混合原料血浆的B19病毒NAT筛查,对于保障我国血液制品安全性具有重要意义。此外,此检测体系还可应用于B19病毒感染的早期诊断,为下一步B19病毒诊断试剂盒的研发奠定了基础。(2)人细小病毒B19-人细小病毒4双重核酸检测体系的建立与评价首先分别合成B19病毒、PARV4的通用检测引物与探针,根据辅助噬菌体M13K07序列设计和合成非竞争性内标的检测引物与探针,并合成或构建B19病毒、PARV4和非竞争性内标的参考品质粒。然后分别对B19病毒和PARV4的qPCR的退火温度、探针浓度和引物浓度以及反应体系中MgCl2+浓度等进行优化,确定了最佳反应体系和条件。确定非竞争性内标在血浆样品中的最佳添加浓度(2.5 copies/μL)后,对双重核酸检测体系分别进行了敏感性、特异性和重复性评价。结果显示B19病毒和PARV4检测下限均可达5 copies/μL;与其他经血传播病毒均无交叉反应;5×106~5×101 copies/μL浓度范围内,B19病毒和PARV4参考品质粒在批内和批间重复实验中各浓度质粒的Cq值变异系数均小于2%;批内实验中,B19病毒和PARV4各浓度参考品质粒拷贝数的平均变异系数分别为4.74%和5.97%,批间实验中平均变异系数分别为8.22%和12.29%。本研究建立的B19病毒-PARV4双重核酸检测体系,既有较高的敏感性、特异性和重复性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所导致的假阴性检测结果。为进行我国献血/献浆人群中B19病毒与PARV4的核酸检测奠定了基础。(3)我国献血/献浆人群中血源性人细小病毒的检测应用本研究建立的B19病毒-PARV4双重核酸检测体系,对我国北京地区和西安地区共计1151份单人份献血员血浆进行B19病毒和PARV4核酸检测。结果显示,共有5份单人份血浆为B19病毒核酸阳性,总阳性率为0.43%,病毒载量为6.80×102~1.38×105 copies/m L;其中西安地区B19病毒DNA阳性率为0.3%(3/1000),北京地区阳性率为1.32%(2/151);而所有血浆均为PARV4核酸阴性。应用本研究建立的B19病毒通用核酸检测体系,对我国三家不同血液制品企业的共计235份混合原料血浆样品进行了B19病毒核酸检测。结果显示,169份(169/235,71.91%)样品存在B19病毒污染,病毒载量为5.18×102~1.05×109IU/m L;其中115份样品(115/169,68.05%)的B19病毒核酸阳性的样品病毒载量高于104 IU/mL。结果表明,本研究中献血人群的B19病毒和PARV4核酸阳性率和病毒载量均较低。但混合原料血浆中B19病毒的污染率和污染程度相对较高,使得血液制品存在传播B19病毒的潜在风险,因此建议我国血液制品企业对原料血浆进行B19病毒NAT筛查,对于保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。(4)我国献血/浆人群中人细小病毒B19分子特性分析对123份B19病毒核酸阳性血浆样品进行了B19病毒NS1-VP1u区的克隆和测序,与GenBank上的B19病毒参考序列多重比对后,进行系统发育分析和重组分析。系统发育分析结果显示,在我国至少有3种亚型(1a、1b和3b)的B19病毒传播,其中1a亚型占主导地位(78/123,63.41%),其次为3b亚型(21/123,17.07%)和1b亚型(12/123,9.76%),没有B19病毒2型的存在。重组分析结果显示,有4个序列为B19病毒1a/3b重组型,5个序列中没有检测到重组信号,可能为B19病毒新的亚型。此外,对部分样品中B19病毒近全长序列进行了克隆与测序,与GenBank上的B19病毒参考序列多重比对后,进行系统发育分析。共获得6个B19病毒近全长序列,系统发育分析显示其均为B19病毒1a亚型。本研究首次发现在我国至少有3种亚型B19病毒(1a、1b和3b)的流行,并首次发现B19病毒1a/3b重组型和可能新基因亚型的存在。有助于了解不同基因型B19病毒在我国的流行情况及其进化趋势,对于B19病毒感染的预防和控制以及保障输血和血液制品病毒安全性具有重要意义。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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