阿法替尼联合利尿酸治疗非小细胞肺癌突变耐药细胞株的效果和机制研究

发布时间：2018-01-16 02:09

本文关键词：阿法替尼联合利尿酸治疗非小细胞肺癌突变耐药细胞株的效果和机制研究　出处：《广西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景与目的:众周所知,肺癌是中国乃至世界的头号癌症杀手,且发病率持续增加,虽然根据肺癌的病理特征分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两类,但据流行病调查发现,非小细胞肺癌(non small-cell lung cancer,NSCLC)占80%~85%。约70%-80%的患者在确诊时已属中晚期,因此,对大部分肺癌患者而言,非手术治疗方式具有重要的作用。目前细胞毒药物化疗对此类人群是有效的治疗选择,但患者总生存期(overall survival,OS)也仅有12个月左右,患者3年及5年生存率分别仅为19%和11%。目前针对晚期非小细胞肺癌的治疗以放化疗和靶向治疗为主,但各方案的有效率仅在20%~30%。而可逆性抑制表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向治疗药物,在用药10个月左右后会出现耐药甚至病情恶化。而对所有Erb B受体家族进行不可逆地抑制的第二代TKI药物阿法替尼(afatinib),虽然对癌细胞生长的阻断更全面、更持久,但也不可避免的产生耐药,加上沉重的经济负担,如何开发出更经济有效的治疗模式是当前医学研究急需解决的问题之一。利尿酸(Ethacrynic acid,EA)是一种亲电子髓袢利尿剂,是第一个被用作抗肿瘤药物研究的谷胱苷肽转移酶S(Glutathion S-transferases,GSTs)抑制剂,可直接作用于GSTs的底物以阻断其发挥作用,或与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)硫醇基发生Michael加成反应以清除体内GSH,从而抑制GSTs活性,增强肿瘤细胞的敏感性。近年研究发现EA及其衍生物除了具有利尿作用外,高浓度条件下还可作为GST和WNT的抑制剂,在乳腺癌中发挥一定的抗肿瘤作用。近期研究还发现降低GSH在体内的合成可以逆转不可逆TKI afatinib的耐药治疗。而关于afatinib联合EA在肺癌中的用药研究至今尚未见报道,因此我们拟进行afatinib联合EA治疗突变型非小细胞肺癌的研究,一方面分析其联合用药效果,另一方面探讨其可能的功能机制,为临床治疗过程中非小细胞肺癌的联合用药提供理论基础和试验依据。材料与方法:体外实验:对人NSCLC原发性耐药细胞株A549和继发性耐药细胞株H1975应用EGFR-TKI afatinib和谷胱甘肽转移酶抑制剂EA单用和联合应用进行研究。应用CCK8法检测afatinib和EA单药对细胞的杀伤作用,计算各单药的IC50,同时检测联合用药的协同效应;应用流式细胞仪检测afatinib和EA单药和联合用药对A549、H1975细胞的周期、凋亡的影响;应用Transwell法检测单药和联合用药后A549、H1975细胞的侵袭、迁移能力的变化;以继发性耐药的H1975为研究对象,Blank组、afatinib组、EA组及联合用药组作用24h后,进行转录组学测序并分析,通过对基因的表达差异分析,筛选出发挥作用的基因,利用RT-PCR检测筛选出的基因的相对表达量。体内实验:将接种了A549、H1975移植瘤的裸鼠模型随机分为两组,即A549组、H1975组,每组再随机分为4组,(1)Blank组:PBS组;(2)afatinib组:afatinib 25mg/kg/d;(3)EA组:EA 20mg/kg/d;(4)afatinib+EA组:afatinib 25mg/kg/d+EA 20mg/kg/d,灌胃给药,每7天一个周期,共三个周期,每周两次测量肿瘤体积大小,绘制肿瘤的生长曲线,21天后取瘤称取裸鼠体重,了解联合用药治疗对裸鼠移植瘤的抑制作用。结果:1.1 Afatinib、EA对A549、H1975细胞的杀伤作用分别用afatinib、EA单药和联合用药处理A549、H1975细胞48h后,观察到单药组及联合用药组具有不同的杀伤细胞的效果。随着药物浓度的递增,各处理组杀伤细胞的效果逐渐增强,其中,联合用药组明显强于各单药组,协同增效作用明显。One-way ANOVA检验分析结果显示,联合用药组对细胞的杀伤效应优于afatinib单药组,并呈现剂量依赖的抗增殖效应,差异有统计学意义(p0.05)。采用Bio Calcusyn软件计算联合用药的CI值,发现随着药物浓度的增高,杀伤效果逐渐增强,尤其对于继发性耐药的H1975细胞表现出强烈的协同效应(CI0.3)。1.2 Afatinib联合EA能抑制A549、H1975细胞的体外、体内增殖采用CCK8法检测相同浓度条件下对A549、H1975细胞杀伤的影响。结果显示联合用药组处理后的细胞杀伤率均明显高于同浓度下afatinib组、EA组,对H1975杀伤的影响较A549尤为明显。通过测量各组裸鼠移植瘤体积,单药组、联合用药组平均瘤体积均低于Blank组。A549组中Blank组、afatinib组、EA组、联合用药组肿瘤平均体积分别为1554.7±340.22mm3、604.6±87.80mm3、1093.5±144.53mm3、402.8±89.61mm3;H1975组中Blank组、afatinib组、EA组、联合用药组肿瘤平均体积分别为870.7±126.23mm3、484.1±76.65mm3、723.3±135.72mm3、82.9±24.71mm3。实验结果显示联合用药组瘤体积明显小于Blank组及各单药组,与afatinib组相比差异有统计学意义(p0.05)。A549组中Blank组、afatinib组、EA组、联合用药组抑瘤率分别为0%、51.75±9.17%、29.25±10.37%、69.76±4.25%(F=18.345,p0.05);H1975组中Blank组、afatinib组、EA组、联合用药组抑瘤率分别为0%、48.72±10.02%、23.54±12.76%、84.12±8.27%(F=50.192,p0.05)。其中,联合用药组抑瘤率最高,说明联合用药对抑制移植瘤的生长具有协同作用,与细胞体外实验结果相一致。1.3 Afatinib联合EA对A549、H1975细胞周期、凋亡的影响CCK8法实验结果显示联合用药组较各单药组能够明显协同抑制肿瘤细胞的增殖,这种对肿瘤细胞的影响可能与细胞周期、凋亡及其机制有关,因此我们应用流式细胞仪检测单药和联合用药对肿瘤细胞周期、凋亡的影响。细胞周期检测结果显示:对于A549细胞,联合用药组与Blank组、各单药组比较,G0/G1期细胞的比例明显增加(p0.05);对于H1975细胞,联合用药组S+G2期细胞的比例明显增加(p0.05)。细胞凋亡检测结果显示:单药组处理A549、H1975细胞48h后均可促使其凋亡,凋亡率分别为2.5%、2.9%、11.3%、4.7%。联合用药组细胞凋亡均有所增加,分别为5.7%、41.8%,差异有统计学意义(p0.05),提示afatinib联合EA可显著协同诱导H1975细胞的凋亡。1.4 Afatinib联合EA对A549、H1975细胞迁移、侵袭能力的影响Transwell法实验观察对A549、H1975细胞迁移、侵袭能力的影响。结果显示:各单药组、联合用药组穿过滤膜进入下室的细胞数较Blank组均减少,联合用药组较各单药组穿过滤膜进入下室的细胞数均减少,差异均具有统计学意义(p0.05);在侵袭实验中,A549细胞afatinib组、H1975细胞各单药组、联合用药组细胞分解细胞外基质穿过滤膜进入下室细胞减少,联合用药组较各单药组进入下室的细胞数均减少,差异均有统计学意义(p0.05);而A549细胞EA组较Blank组进入下室细胞数未见明显减少,差异无统计学意义(p0.05)。1.5 Afatinib联合EA对H1975细胞转录组学检测及机制研究转录组学(Transcriptomics)是一门研究细胞基因转录情况和转录调控规律的学科,通过在RNA水平上对基因的表达进行研究。转录组测序(RNA sequencing)对基因功能和基因结构整体水平的研究,可以揭示药物靶点生物学过程。本研究中以继发性耐药的H1975细胞为对象,Blank组、各单药组及联合用药组作用24h后,提取RNA进行转录组测序,通过对文献的参考及对转录组测序中基因表达差异分析,我们找出EGFR、P53、TNFSF14、VEGFA、WNT5A、WNT10A、MAPKAP1及MAPK8IP3等相关基因,利用RT-PCR检测筛选出的基因的相对表达量,结果与测序结果基本一致,表明转录组测序结果是可靠的。通过对差异表达的基因分析我们找出发现主要与20条信号通路相关,其中,与癌症最密切的是Pathway in cancer、Wnt signaling pathway和cytokine-cytokine receptor interaction这三条信号通路。根据基因表达差异数据分析我们发现了155个上调和175个下调的基因。(筛选条件:FDR0.01,Log Fold-change≥2和≤-2,Pvalue0.001)。为后续进一步研究联合用药对抗继发性耐药NSCLC的分子机制提供重要的数据资源。结论:1.Afatinib或EA单独或联合应用均对A549、H1975细胞具有杀伤作用;联合用药对A549细胞在较大剂量(afatinib IC50+EAIC50)时有协同杀伤效应;对H1975细胞具有强烈的协同杀伤作用,CI0.3。2.Afatinib联合EA可在体外、体内杀伤耐药非小细胞肺癌细胞A549、H1975,尤其对继发性耐药的肺癌细胞H1975杀伤效果尤为明显。3.Afatinib和/或EA对A549、H1975细胞周期具有阻滞作用,对细胞凋亡具有协同促进作用;对A549、H1975细胞的迁移、侵袭能力具有抑制作用。4.Afatinib联合EA与afatinib单药对人肺癌细胞H1975的基因表达差异,上调基因有FGFR2、TNFRSF4、WNT6、FZD6、CCR1、IL1R2等,下调基因有CBLC、SMO、IL12B、CXCL14、CX3CR1、NGFR等;可能通过Pathway in cancer、Wnt signaling pathway和cytokine-cytokine receptor interaction这三条信号通路中某些靶点发挥抗继发性耐药NSCLC细胞的作用。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】