细胞周期蛋白依赖性激酶9对同种移植排斥的影响及分子机制研究

发布时间：2018-01-19 05:27

  本文关键词： 同种移植 CDK9 CD4~+T细胞 免疫耐受 信号通路　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：迄今为止,器官移植仍是挽救终末期脏器衰竭的最有效措施。器官移植包括同种移植、异种移植和自体移植(同系移植)三大类,其中同种异基因移植是临床最常见的移植类型。移植排斥反应是由多种基因相互作用引起的复杂病理生理过程,是造成移植物损伤并最终导致治疗失败的最重要因素。近年来免疫抑制疗法的成功实施已使移植物短期存活方面得到明显改善,然而移植物长期存活和患者生存率方面并未获得明显进步。目前临床上常用的免疫抑制剂既无法消除复杂基因调控引起的持续免疫损伤,同时还显著抑制患者免疫功能,降低移植受者的生存质量,这是目前器官移植领域面临的严重问题。因此,研究寻找可在炎症起始阶段有效干预控制、靶向多种移植排斥相关基因的靶分子,设计出更高效高选择性的抑制移植排斥反应的制剂,对于进一步阐明移植排斥机制和改善临床器官移植成功率具有重要理论和实际意义。细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cyclin-dependentkinase9,CDK9)是正性转录延长因子b(Positive transcription elongation factor b,P-TEFb)的催化激酶,通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,RNAPⅡ)的羧基末端和负性转录延长因子,使转录从起始部位开始延伸。CDK9磷酸化RNAPⅡ是细胞转录延伸过程中的关键限速环节。初始反应基因(Primary Response Genes,PRGs)是一组诱导细胞内外信号,且其表达无需启动蛋白质合成的基因。在信号反应基因的转录链中,这些"第一反应"的信号发挥关键作用,包括神经细胞的生存可塑性,心肌应激反应,葡萄糖代谢等多种复杂的的生物学过程。越来越多的研究发现CDK9可通过控制初始反应基因的转录,在炎症发生发展中起中心调控作用。CDK9包括两个亚型,CDK9_(42)和CDK9_(55),两个亚型在不同器官组织和细胞中的表达各有不同。例如有研究发现,随着培养时间的增加,体外培养的大鼠肝细胞CDK9_(55)分子亚型的表达量逐渐减少,CDK9_(42)分子亚型的表达量逐渐相应增多。鉴于CDK9对炎症的中心调控作用,本论文对CDK9是否增强同种移植排斥反应及其分子调节机制进行系统的深入研究,目的是阐明CDK9抑制剂对同种移植物生存状态的影响,并研究其作用机制、调控因素及其调控的相关信号转导通路,明确CDK9的两个分子亚型在同种排斥反应中的差异表达,从而为研究靶向CDK9特异亚型诱导同种移植物耐受提供理论和实验依据,为临床器官移植排斥提供新的治疗手段。第一部分同种移植受体CDK9及其伴侣蛋白Cyclin T1表达与移植物生存相关性研究研究方法1.同种排斥过程中移植物CDK9及其伴侣蛋白Cyclin T1的动态表达1.1构建小鼠同系和同种移植模型无菌条件下,分别将BALB/c和C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到BALB/c小鼠背部并进行包扎,此两种模型分别作为同系移植组和同种移植组。同种移植组进一步分为PHA747691(CDK9抑制剂)给药组和生理盐水对照组:在移植术进行第-1、1、3、5、7、9、11日向实验组小鼠灌胃给药PHA767491(3,10,30mg/kg);等体积生理盐水为对照组。于移植术后第4、8、12和16天脱椎处死小鼠,每组至少3只,分离移植皮片和脾脏。1.2移植物CDK9及其伴侣蛋白Cyclin T1的表达取移植术后第4、8、12和16天的同系移植组和同种移植对照组的皮肤移植物,提取总RNA,利用RT-qPCR方法,检测CDK9及其伴侣蛋白CyclinTl在同种排斥过程中的表达及变化。2.CDK9抑制剂对同种移植排斥受体脾CD4~+ T细胞差异表达基因的影响在排斥高峰期处死同种移植对照组小鼠,用CD4~+T细胞分离试剂盒分离纯化脾CD4~+ T细胞,用3μM PHA767491或等量PBS处理细胞2h。从本实验室前期建立的相同模型移植排斥相关基因SAGE文库中选出一定数量的差异表达基因,用RT-qPCR方法检测CDK9抑制后这些差异表达基因在受体小鼠排斥高峰期脾CD4~+T细胞中的表达。3.CDK9抑制剂对同种移植物生存期的影响小鼠同种皮片移植术后第7天,拆除包被物,逐日观察记录两组模型小鼠移植物的生存状况,以移植皮片90%坏死作为完全排斥。移植术后第12天处死小鼠,HE染色观察移植物的病理变化,免疫组化染色检测移植物CDK9的表达。4.CDK9抑制剂对同种移植受体脾CD4~+ T细胞比例的影响移植后第12天处死小鼠,流式细胞术分析CDK9抑制剂对同种移植受体排斥高峰期脾CD4~+T细胞的影响。5.CDK9抑制剂对同种移植受体皮肤移植物CD4~+ T细胞的影响取移植术后第12天的同种移植受体小鼠的移植皮片,常规操作进行免疫组化染色,检测抑制CDK9对排斥期受体皮肤移植物CD4~+T细胞浸润的影响。研究结果1.CDK9表达与同种排斥具有显著正相关性:CDK9及其伴侣蛋白Cyclin T1在同种移植对照组中的表达显著高于同系移植组。CDK9的表达水平在同种排斥高峰期达到最高,并随着排斥反应的缓解而降低;在同种排斥反应的发生发展中CyclinT1与CDK9的表达趋势一致。结果表明CDK9表达与同种排斥反应具有显著正相关性。2.CDK9调控CD4~+ T细胞同种排斥相关基因:CD4~+ T细胞是同种移植排斥反应发生与否的决定因素,本论文从本实验室前期建立的CD4~+T细胞介导的同种移植排斥基因SAGE文库中选取相关差异表达基因,并检测CDK9抑制对这些移植排斥相关基因的调控作用。结果显示,PHA767491处理组的STAT1、JAk2、Socs5、RhoA、Ly6e、Med8和Med11的mRNA水平较对照组显著降低,而Gna13和Fbxw4的mRNA水平较对照组明显升高,表明CDK9上调CD4~+T细胞介导的同种排斥反应相关基因,下调移植耐受基因。3.CDK9抑制明显延长同种移植物存活期:同系移植组未发生排斥;同种移植对照组的皮肤移植物较早出发生排斥。与同种对照组相比,PHA767491给药组移植物排斥发生延后且进程较缓慢。对照组小鼠移植皮片在过继后第10-11天发生排斥,而PHA767491给药组在第17-18天排斥(p0.05)。结果表明CDK9抑制剂显著改善移植物生存状态,延长其存活期。4.移植物病理及免疫组化染色结果:HE染色切片显示,对照组的移植皮片炎性反应明显,有大量单核巨噬细胞浸润;而在PHA767491给药组,移植皮片组织的炎性反应较轻,单核巨噬细胞浸润明显减弱。免疫组化染色结果显示,在PHA767491处理组,皮肤移植物处CDK9表达水平显著降低。结果提示CDK9表达水平与排斥严重程度正相关,CDK9抑制可明显延长同种皮肤移植物生存期。5.CDK9抑制可显著降低同种移植受体CD4~+T细胞比例:流式分析结果表明,同种移植组受体脾CD4~+T细胞显著高于同系移植组,而PHA767491可显著抑制同种排斥反应引起的CD4~+T细胞扩增。免疫组化染色结果表明,PHA767491体内应用可显著抑制同种皮肤移植物CD4~+T细胞浸润。结果进一步证实CDK9高表达促进同种移植排斥反应。第二部分CDK9抑制剂对CD4~+T细胞介导的同种移植排斥的影响及机制研究研究方法1.构建CD4~+T细胞过继转输C57BL/6-SCID小鼠同种皮肤移植模型无菌状态下,将野生型C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到SCID小鼠右侧背部,并用创口贴和透明胶带进行包扎固定,术后第7天拆包。移植术3周后,移植皮片愈合。分离纯化野生型BALB/c小鼠脾CD4~+ T细胞,分别用PHA767491(3μM)和等体积PBS处理细胞6小时,然后分别通过腹腔注射过继转输到上述C57BL/6-SCID同种移植受体小鼠体内作为PHA767491处理组和对照组。2.CDK9抑制剂对CD4~+ T细胞介导的同种皮片移植物生存的影响过继CD4~+T细胞后,逐日观察并记录两组小鼠移植皮片生存情况。过继后第12天对移植皮片HE染色,显微镜下观察其病理变化。3.CDK9抑制剂对过继转输CD4~+ T细胞介导的同种排斥反应的影响3.1 CDK9抑制剂对过继转输CD4~+ T细胞细胞因子谱的影响CD4~+T细胞过继第12天,脱椎处死两组小鼠,获得小鼠移植皮片、移植同侧腋窝引流淋巴结和脾。利用细胞因子蛋白芯片分别检测皮肤移植物、腋窝引流淋巴结和脾CD4~+T细胞中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和IL-22的水平。3.2 CDK9抑制剂对过继转输CD4~+T细胞中同种Teff活化的影响CD4~+T细胞过继后第7天,提取脾同种反应性CD4~+CD25-Teff,并提取野生型BALB/c小鼠Teff作为阴性对照,利用流式细胞术检测细胞CD69、CD25和胞内IL-2水平。3.3 CDK9抑制剂体外处理对Teff增殖能力的影响提取野生型BALB/c小鼠CD4~+CD25-Teff,用PHA767491(3μM)和等量的PBS处理Teff2小时,之后加入抗CD3抗体(2 μg/ml)和抗CD28抗体(1μg/ml)刺激细胞,利用CCK8法检测Teff增殖情况。4.CDK9抑制剂对CD4~+CD25+Foxp3+Treg细胞的影响4.1 CDK9抑制剂对同种移植受体Treg细胞亚群比例的影响细胞过继后第12天处死两组小鼠,应用CD4、CD25、Foxp3流式抗体对小鼠脾细胞进行荧光染色,利用流式细胞术检测CD4~+CD25+Foxp3+ Treg细胞在CD4~+细胞中的比例。4.2 CDK9抑制剂体外处理对Treg细胞增殖能力的影响分离野生型BALB/c小鼠脾脏CD4~+CD25+Treg细胞。用PHA767491(3μM)或等量的PBS处理分离的Treg细胞2小时,之后加入抗CD3抗体(2 μg/ml)和抗CD28抗体(1 μg/ml)刺激细胞,利用CCK8法检测Treg细胞增殖状况。4.3 CDK9抑制剂体外处理对Treg细胞免疫负调控功能的影响分离纯化野生型BALB/c小鼠脾脏CD4~+CD25+Treg和CD4~+CD25-Teff细胞。用PHA767491(3μM或5μM)或等量的PBS处理分离的Treg细胞2小时,之后与Teff细胞混合,并加入抗CD3抗体(2μg/ml)和抗CD28抗体(1μg/ml)刺激细胞,利用CCK8法检测Treg对Teff的抑制。研究结果1.成功建立同种移植模型:移植术后3周,移植部位愈合,移植皮片生长良好,表明C57BL/6-SCID小鼠同种皮肤移植模型成功建立。对照组的移植物在细胞过继后第12-15天发生排斥,而PHA767491处理组在第23-27天排斥,表明CDK9抑制剂处理可明显减弱CD4~+ T细胞介导的同种排斥反应,延长同种移植物生存期。2.CDK9促进Th1极化:在同种皮肤移植物和脾脏CD4~+T细胞中,PHA767491处理组IFN-y水平较对照组显著降低,而IL-4和IL-10的水平显著升高。腋窝引流淋巴结未检测到细胞因子水平改变。IL-17和IL-22均无显著变化。结果提示CDK9通过促进Th1极化增强同种移植排斥。3.CDK9促进同种反应性Teff的活化和增殖:为探讨CDK9是否在细胞活化阶段促进同种排斥反应,本论文在细胞过继后第7天(过继转输的T细胞开始识别同种抗原)提取受体小鼠脾Teff,利用流式细胞术和CCK-8法检测细胞活化和增殖情况。结果显示,PHA767491处理组Teff的CD69、CD25和胞内IL-2水平及增殖能力均明显低于对照组。结果表明CDK9在同种反应性Teff活化和增殖过程中起促进作用。4.CDK9提高同种移植受体Treg细胞比例:PHA767491处理组小鼠Treg细胞亚群在脾CD4~+T细胞中的比例显著高于对照组。而两组Treg的增殖能力无显著区别,PHA767491处理对Treg的抑制能力也无显著影响。结果提示PHA767491可通过抑制Teff的活化和增殖,相应提高同种移植受体Treg细胞比例。第三部分cDK942和CDK9_(55)亚型在同种移植排斥中作用机制的研究研究方法1.CDK9两个亚型在同种抗原刺激下的表达用野生型C57BL/6小鼠的脾细胞制备的可溶性同种抗原对PHA767491(3μM)或PBS预处理2h的BALB/c小鼠CD4~+ T细胞进行梯度时间刺激,留取细胞培养上清液,备用。用Western blot检测各时间点CDK9_(42)、CDK9_(55)、RNA聚合酶Ⅱ和β-actin的表达。2.CDK9两亚型在同种抗原刺激下的转位分离上述细胞的细胞核蛋白和胞浆蛋白,用Western blot和ELISA检测各时间点细胞核、胞浆和细胞培养上清液中的CDK9_(42)、CDK9_(55)以及其伴侣蛋白Cyclin T1的表达。3.CDK9_(42)的核质转位促进形成炎症微环境为探究CDK9_(42)的转位对细胞外微环境所起作用,本文用ELISA检测上述方法2中细胞培养上清液中IFN-y、IL-1β和IL-6的水平。4.CDK9_(42) 活化 STAT1/IFN-γ 信号通路4.1 CDK9活化的移植排斥相关基因与STAT1相关用CDK9 siRNA转染RAW264.7细胞系,从CD4~+T细胞介导的移植排斥基因SAGE文库中选出多个基因,用实时定量PCR检测CDK9 siRNA转染的RAW264.7细胞系中相关基因水平,探讨CDK9对移植排斥反应相关信号通路的作用。4.2 PHA767491显著抑制STAT1的活化用可溶性同系抗原或同种抗原对IL-6单克隆抗体、IFN-γ单克隆抗体、PHA767491(3μM)或等量PBS预处理2h的野生型BALB/c小鼠脾细胞进行刺激,用磷酸化STAT1和磷酸化STAT3的流式抗体染色,用流式细胞术分析STAT1和STAT3的活化。5.CDK9主要通过调控STAT1促进同种排斥反应建立小鼠同种皮肤移植模型,移植术后12天处死小鼠并取移植皮片进行固定、石蜡包埋、切片、免疫组织化学染色,显微镜下观察皮肤移植物CDK9、STAT1、STAT3 和 STAT5 的表达。研究结果1.CDK9_(42)是同种排斥的主要分子亚型:同种抗原刺激后15min开始,CDK9_(42)亚型的表达水平逐渐升高,而CDK9_(55)明显降低,RNA聚合酶11与CDK9_(42)亚型的表达趋势基本一致。PHA767491处理显著抑制这三者的表达,提示CDK9_(42)是应答同种抗原刺激、促进下游免疫反应的主要分子亚型。2.CDK9_(42)转位促进形成炎症微环境:随着同种抗原刺激,CDK9_(42)从细胞核向胞浆转位,并释放到胞外,而CDK9_(55)较稳定地在核内表达。CyclinT1相应转位,但其表达趋势与CDK9两个亚型均不一致。对照组细胞培养上清液中IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著升高,表达趋势与CDK9_(42) 一致。PHA767491可显著抑制CDK9_(42)的转位以及上清液中促炎细胞因子的表达,提示CDK9_(42)的转位可促进形成炎症微环境。3.CDK9抑制剂明显降低STAT1相关基因表达:CDK9抑制组的CXCL9、CXCL10、CXCL11、GBP4、STAT1、JAk2 和 Socs5 的 mRNA 表达水平较对照组显著降低,这些基因均与STAT1相关,涉及细胞增殖、细胞活化、细胞生长与维持和信号传导;与上述基因相比,与STAT3相关的基因如C4a、CXCL12、Chl1和Socs3无显著改变。4.CDK9主要通过调控STAT1/IFN-γ信号通路影响同种排斥反应:同种抗原刺激下,STAT1的活化水平明显高于STAT3,IFN-y阻断组STAT1和STAT3的活化均被显著抑制,但IL-6阻断组仅STAT3的活化受抑制,而且PHA767491显著抑制磷酸化STAT1和STAT3的表达。结果表明,与STAT3相比,STAT1在同种反应中发挥更重要的促炎作用;CDK9在此过程中可能主要通过活化STAT1/IFN-y信号通路而促进同种排斥反应。5.免疫组化染色结果:与对照组相比,PHA767491给药组移植物CDK9和STAT1受到显著抑制,STAT3的表达也相应降低。STAT5在同种排斥组和PHA767491处理组均低水平表达,两组间无显著差异,提示CDK9主要通过调控STAT1促进同种排斥反应。全文结论1.同种移植物CDK9及其伴侣蛋白CyclinT1表达水平与移植物的损害程度密切正相关。CDK9抑制剂体内应用可显著延长同种移植物生存期。2.CDK9抑制剂体内应用可明显提高同种移植受体CD4~+CD25+Foxp3+ Treg细胞比例,显著抑制Teff活化和增殖,而对Treg的增殖和免疫负调控功能无明显影响。3.CDK9_(42)是应答同种抗原刺激、促进下游免疫应答的主要分子亚型,调控多种移植排斥相关基因,其转位可促进形成炎症微环境。CDK9主要通过活化STAT1/IFN-γ信号通路促进同种排斥反应。全文创新点1.首次研究CDK9在同种移植排斥反应中的作用,证实CDK9抑制剂PHA767491可明显延长小鼠皮肤同种移植物生存期,诱导移植免疫耐受形成。研究结果为临床器官移植排斥提供新的治疗手段。2.首次证明CDK9可调控多种同种移植排斥相关基因,促进同种排斥反应发生发展,并在此过程中起中心调控作用。研究结果为进一步揭示移植排斥的分子调控机制提供新的研究思路。3.首次证明CDK9_(42)是应答同种抗原刺激、促进下游免疫应答的主要分子亚型,其转位可促进形成炎症微环境。研究结果为研发高选择性CDK9_(42)抑制剂并应用于抗炎抗移植排斥奠定重要理论和实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R617
，

本文编号：1442848