蛋白酶体抑制剂通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路防治牙周病的实验研究

发布时间：2018-01-19 05:33

本文关键词： 抗炎作用骨吸收人牙周膜细胞牙周病蛋白酶体抑制剂　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牙周病是口腔常见病,也是成人牙齿脱落的主要原因。细菌及其代谢产物是牙周病的启动因子。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,在牙周病的发生与发展中扮演着重要角色。LPS刺激宿主细胞,激活炎症相关信号通路,如核因子κB(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,导致大量炎症因子的过量表达和释放,从而引起组织炎症反应。泛素蛋白酶体系统(UPS)介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制,参与信号传导、凋亡、细胞周期和抗原呈递等调控。参与牙周炎症反应的NF-κB和MAPK信号通路同样受到UPS的调控。针对UPS调控机制,蛋白酶体抑制剂得到广泛关注,最早用于肿瘤的研究。Bortezomib是第一个被用于临床治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂,近年来,逐渐被用于非肿瘤性疾病的研究。课题组成员前期研究发现bortezomib能够通过抑制泛素连接酶的关键抑制因子-去泛素化酶头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)的降解,而抑制破骨细胞的分化。此外,bortezomib还能够促进鼠牙周膜细胞的细胞分化和矿化。这些研究均表明bortezomib有望成为治疗牙周病的有效药物。然而蛋白酶体抑制剂对牙周病的治疗假设仍有较多的基础科研问题尚未阐明,首先是药物安全性和组织特异性。蛋白酶体抑制剂所产生的生物学效应具有明显的组织差异性和浓度依耐性。相同浓度的蛋白酶体抑制剂对不同组织细胞会产生不同效应,不同浓度蛋白酶体抑制剂对相同组织细胞甚至会产生相反效果。牙周膜细胞(PDLCs)是牙周组织改建和维持牙周健康的重要细胞。由上可见,蛋白酶体抑制剂在牙周病治疗领域作为药物开发具有极高的潜力。然而,需要对蛋白酶体抑制剂对牙周膜细胞的药物安全性、组织特异性、作用机理等进行系统研究。所以本研究在课题组前期研究的基础上,通过体外研究探讨bortezomib对牙周膜细胞的药物安全性、抗炎作用及其可能的作用机制;通过LPS联合结扎术构建大鼠牙周炎模型,进一步探讨bortezomib的体内抗炎效果,以期为蛋白酶体抑制剂治疗牙周病的科研成果转化提供有力的实验依据。本实验设计共分为以下六个部分:第一部分人牙周膜细胞的原代培养及生物学特性鉴定目的:原代培养和鉴定h PDLCs,为后期体外实验提供细胞保障。方法:收集12至15岁患者因正畸治疗拔除的健康前磨牙,采用组织块酶消化法原代培养h PDLCs。采用免疫细胞化学、免疫荧光、细胞克隆实验和细胞增殖实验检测细胞的生物学特性。结果h PDLCs呈成纤维样,波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性;14天即可见细胞集聚生长,克隆形成;连续9天生长曲线成“S”形。结论:组织块酶消化法可以成功培养出h PDLCs,细胞为中胚层间充质细胞,无上皮细胞的污染,克隆及增殖能力强。第二部分蛋白酶体抑制剂bortezomib对人牙周膜细胞的药物安全性研究目的:了解Bortezomib对h PDLCs的药物安全性,同时为后期实验筛选出安全实验浓度。方法:本实验通过细胞增殖实验、流式细胞凋亡和周期实验检测bortezomib(0-10n M)对h PDLCs增殖活力、细胞周期和细胞凋亡的影响,通过western blot、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)实验和细胞增殖实验检测bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)在LPS刺激下,对h PDLCs中caspase3和cyclin D1基因和蛋白表达的影响,以及对h PDLCs增殖活性的影响。结果:4 n M及以下浓度的bortezomib不会影响h PDLCs的增殖,然而会使h PDLCs停留在G1期,10 n M以下浓度的bortezomib不会影响h PDLCs的凋亡。在LPS刺激下,1 n M以内的bortezomib对h PDLCs的增殖无明显影响,但抑制cyclin D1基因和蛋白的过表达,抑制caspase3基因表达,轻度抑制cleaved-caspase3蛋白表达,表明bortezomib抑制h PDLCs的过度增殖和凋亡。结论:1n M以内的bortezomib对h PDLCs表现出良好的药物安全性。本研究采用0.25 n M、0.5 n M和1 n M的bortezomib进行后续体外实验。第三部分Bortezomib对LPS诱导的人牙周膜细胞炎症反应抑制作用目的:本实验通过分析在LPS刺激下,bortezomib对h PDLCs中炎症因子基因表达和蛋白分泌的影响,探讨bortezomib的体外抗炎作用。方法:Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)预处理h PDLCs 1 h,再与1μg/m L LPS共同干预h PDLCs 3、6、12和24 h,采用RT-PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的基因表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白分泌量。结果:LPS处理h PDLCs3 h到24 h,均会促进炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)基因的表达,其中LPS作用6 h后的基因相对表达量最高。0.25 n M至1 n M浓度的bortezomib预处理可以明显抑制LPS刺激细胞引起的炎症因子的基因表达量和蛋白分泌量的增加。结论:0.25n M至1n M浓度的bortezomib对LPS所诱导的体外牙周细胞炎症反应表现出明显的抗炎作用,表明bortezomib的体外有效抗炎浓度在皮摩尔级。提示bortezomib在牙周病的防治方面具有深入研究价值。第四部分Bortezomib通过NF-κB信号通路对人牙周膜细胞炎症反应抑制作用目的:本实验通过研究在LPS刺激下,bortezomib对h PDLCs中NF-κB信号通路活性的影响,探讨bortezomib在牙周病治疗方面的抗炎机制。方法:Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)预处理h PDLCs6 h或者1 h,再与1μg/m L LPS共同干预h PDLCs 0.5 h或者6 h,采用western blot方法检测NF-κB信号通路上重要的抑制因子IκBa总蛋白和磷酸化水平,免疫荧光实验检测NF-κB/p65核移情况。结果:(1)LPS处理h PDLCs 0.5 h时,IκBa的蛋白水平与磷酸化水平稍有下调,但与空白对照组间比较没有统计学差异;当bortezomib预处理细胞6 h时,IκBa的蛋白水平与磷酸化水平均随着bortezomib浓度的增加而增加。(2)Bortezomib预处理h PDLCs 1 h,再与LPS共同作用细胞6 h时,LPS能够显著增加IκBa的磷酸化水平和促进IκBa蛋白水平的上调;IκBa蛋白水平与磷酸化水平均有随着bortezomib浓度增加而增加的趋势。(3)免疫荧光结果显示:NF-κB/p65定位于细胞质内,当LPS刺激细胞0.5 h和6 h时,NF-κB/p65移位进入细胞核,bortezomib预处理能够抑制这一反应过程。结论:Bortezomib可以通过抑制IκBa蛋白的降解,抑制NF-κB/p65的核移,进而调控NF-κB信号通路的活性,而抑制下游炎症因子的转录。第五部分Bortezomib通过MAPK/AP-1信号通路对人牙周膜细胞炎症反应抑制作用目的:本实验通过研究在LPS刺激下,bortezomib对h PDLCs中MAPK信号通路的影响,及MAPK磷酸酶1(MKP1)和下游重要转录因子激活蛋白-1(AP-1)活性的影响,进一步探讨bortezomib的抗炎机制。方法:(1)Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)预处理细胞6 h,与1μg/ml LPS继续共同干预细胞0.5 h和1 h,western blot检测MAPKs(p38、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶5(ERK5))蛋白表达和磷酸化水平;(2)Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)预处理细胞6 h,与1μg/ml LPS继续共同干预细胞0.5 h,western blot检测MKP1蛋白表达水平,RT-PCR检测MKP1基因表达水平;Western blot检测AP-1(c-Jun和c-fos)蛋白表达及磷酸化水平;免疫荧光检测pc-Jun和pc-fos核内表达水平。结果:(1)1μg/ml LPS促进h PDLCs中p38、JNK、ERK1/2和ERK5磷酸化水平的上调,但bortezomib选择性的抑制p38和ERK5的磷酸化,而对JNK和ERK1/2的磷酸化无抑制作用。(2)1μg/ml LPS促进h PDLCs中MKP1的蛋白和基因表达水平的轻微上调,随着bortezomib浓度的增加,这种上调趋势明显加强。(3)1μg/ml LPS促进h PDLCs中c-Jun磷酸化水平的明显上调,c-fos磷酸化水平的轻度上调。而Bortezomib抑制c-Jun和c-fos的磷酸化,其中对c-Jun的抑制作用较强。(4)免疫荧光检测结果与western blot结果具有一致性,1μg/ml LPS能够促进pc-Jun和pc-fos的核内表达,而brtezomib明显抑制这一反应。结论:(1)bortezomib通过抑制MKP1的降解和促进MKP1的表达,抑制MAPKs信号通路蛋白的活化,进一步抑制AP-1的活性,而干预牙周炎症反应。(2)结果提示p38、ERK5和c-Jun是bortezomib的抗炎作用靶点。第六部分动物实验--Bortezomib抑制LPS联合结扎术诱导的牙周炎症反应目的:通过研究bortezomib对大鼠牙周炎进展的影响,探讨bortezomib的体内抗炎作用,进一步为bortezomib治疗牙周疾病的科研成果转化提供有力依据。方法:(1)大鼠上颌双侧第二磨牙牙周局部注射LPS,联合结扎术构建大鼠牙周炎模型,注射LPS之前1 h,牙周局部注射bortezomib(0.01 mg/ml、0.1 mg/ml和1 mg/ml)进行干预,隔两天注射和干预一次,持续4 w。(2)微型计算机断层成像(Micro-CT)扫描样本,进行牙槽骨吸收的线性分析和骨容量分析。(3)样本脱钙,制作组织切片,进行HE染色,免疫组化检测核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)、TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的表达。结果:(1)牙周局部注射LPS联合牙颈部结扎4 w成功构建大鼠牙周炎模型,牙槽骨吸收明显,达根中下份,根分叉暴露,釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶(ABC)之间的距离明显高于正常组,感兴趣区域(ROI)的牙周骨体积占总体积分数比值(BV/TV值)和骨密度值明显低于正常组。Bortezomib干预可以明显抑制牙槽骨的吸收,减少CEJ到ABC之间的距离,增加BV/TV值和骨密度值。(2)HE染色显示:bortezomib抑制牙周组织炎症细胞的浸润。(3)Bortezomib抑制牙周组织中RANKL的过表达,同时促进OPG的表达。(4)LPS联合结扎术可诱导牙周组织中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的过表达;而bortezomib抑制牙周组织中炎症因子的表达。结论:局部使用bortezomib可以抑制牙周炎症组织中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的高表达和减小RANKL/OPG的比值,抑制牙槽骨的破坏吸收。Bortezomib对牙周病的治疗表现出潜在的药物作用,合适剂型和剂量还有待进一步研究。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

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