bFGF在帕金森病模型中的神经保护作用及其机制研究

发布时间：2018-01-23 02:09

  本文关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 帕金森病 α-突触核蛋白 tau蛋白 6-羟基多巴胺 磷酸化 PI3K/AKT/GSK-3信号通路 鼻腔给药 脂质体 CK-1 DCX　出处：《暨南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森(Parkinson’s disease,PD)模型中的作用,并探讨其作用机制。同时对b FGF的药代动力学和安全性进行评价,为帕金森的临床治疗提供理论依据,也为b FGF提供安全有效的给药途径。方法:(1)利用脑立体定位系统将6-OHDA注射到SD大鼠纹状体进行造模,同时采用脂质体载药系统和经鼻给药的方式将b FGF递送入脑。(2)行为学(旋转实验,步态分析实验和旷场实验)检测b FGF和脂质体b FGF对6-OHDA诱导的PD模型的作用。(3)电化学高校液相色谱法(HPLC-ECD)检测大鼠纹状体内神经递质DA及其代谢产物DOPAC和HVA浓度。(4)免疫组化法和免疫印迹法检测纹状体和黑质内TH的表达。(5)尼氏染色法观察尼氏小体。(6)核磁共振扫描成像分析大鼠受损侧纹状体感兴趣区FA,ADC,MD,T2,R2,CBF,MK,KR和KA值。(7)免疫印迹法检测大鼠受损侧黑质内PD相关蛋白的表达。(8)ELISA法测定大鼠血清中b FGF浓度。(9)ELISA法和免疫印迹法共同检测大鼠嗅球,大脑皮质,纹状体,海马和黑质内b FGF浓度。(10)HE染色观察大鼠嗅球,鼻黏膜,黑质,纹状体,肝脏和肺的病理学变化。(11)MTT法测不同浓度的6-OHDA和b FGF对细胞活存活率的影响。(12)扫描电镜观察6-OHDA和b FGF处理后的细胞形态。(13)免疫印迹法检测PD相关蛋白的表达。结果:(1)脂质体b FGF鼻腔给药后30 min能够分布于大鼠嗅球,大脑皮质,纹状体和黑质(p0.05);b FGF鼻腔给药后30 min分布于大鼠嗅球,大脑皮质和纹状体内(p0.05);两给药组相比,脂质体b FGF鼻腔给药后在大脑皮质和纹状体内的含量明显多于b FGF单独给药组(p0.05)。ELISA结果与western结果基本一致。(2)6-OHDA损伤4周后,大鼠旋转圈数达到6r/min,被视为成功模型。(3)6-OHDA注射后造成动物行为障碍,包括:旋转圈数增加,步态紊乱,步幅减小,活动减少,活动频率降低等(p0.05)。脂质体b FGF鼻腔给药后能够显著减少阿扑吗啡(Apomorphine,APO)诱导的旋转圈数,增加旷场中的运动距离,运动频率,延长了步幅,减少了通过时间等(p0.05),这些行为学的改善作用效果明显强于b FGF给药组;而空载脂质体组对PD大鼠的行为学并无影响。(4)6-OHDA很大程度上减少了纹状体内DA,DOPAC和HVA的浓度(91.2%,84.3%,92.3%)(p0.05);与模型组相比,脂质体b FGF对DA的增加具有剂量依赖性(11%,15.4%,25.9%),脂质体b FGF对HVA和DOPAC的上调作用与DA基本一致。b FGF给药组也增加了DA和DOPAC的浓度,但对HVA的浓度几乎没有影响。(5)TH阳性神经元在受损侧纹状体和黑质内的表达量仅为18%和22%(p0.05),极大程度上损伤了神经元。与模型组相比,150μg/kg和300μg/kg两个剂量的脂质体b FGF给药后,TH阳性神经元的含量在纹状体内分别被提高了15%和23%(p0.05),而在黑质内分别上调了20%和25%(p0.05)。600μg/kg的脂质体b FGF和300μg/kg的b FGF在黑质纹状体内对神经元的上调作用并不明显。相同剂量条件下,脂质体b FGF对神经元的促进作用要明显高于b FGF溶液组。免疫印迹结果与免疫组化结果基本保持一致。(6)6-OHDA在纹状体内使尼氏小体的数目减少了约80%(p0.05),脂质体b FGF低、中两个剂量组显著增加了尼氏小体数目(p0.05),组间相比,中剂量组的这种效果最为明显;与模型组相比,b FGF对尼氏小体的数目基本没有增加。(7)受损侧纹状体感兴趣区的FA值明显上调(p0.05),而MD值却被下调(p0.05),ADC在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中并无显著改变;空白组双侧FA、MD和ADC之间无差异;脂质体b FGF和b FGF给药组对这3个参数值均无影响。6-OHDA能够显著上调横向质子弛豫率(p0.05),并降低横向质子弛豫时间(p0.05),中剂量的脂质体b FGF鼻腔给药后下调了横向质子弛豫率,升高了横向质子弛豫时间(p0.05),这两种作用与低剂量之间有显著性差异。另外,6-OHDA能够导致脑血流量的减少(p0.05),150μg/kg和600μg/kg两个剂量的脂质体b FGF鼻腔给药后显著上升了受损侧纹状体内感兴趣区的血流量(p0.05);组间相比,150μg/kg的脂质体b FGF组对血流量的增加作用效果更好(p0.05)。(8)6-OHDA能够减少微管蛋白的表达,增加大鼠黑质内α-syn Ser129位点和tau Ser 396位点的磷酸化,上调CK-1,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);而脂质体b FGF鼻腔给药后,能够增加微管蛋白和DCX的表达,降低大鼠黑质内α-syn Ser129位点和tau Ser 396位点的磷酸化,下调CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信号通路(p0.05);6-OHDA和b FGF对大鼠黑质内DJ-1,Parkin,PINK和Synapsin均没有显著的调控作用。(9)脂质体b FGF和b FGF经鼻腔给药后,在大鼠体内的血药浓度-时间曲线符合二室开放模型,加权为1。150μg/kg,300μg/kg和600μg/kg的脂质体b FGF与300μg/kg的b FGF鼻腔给药后的消除半衰期分别为174.5±29.2min,207.4±73.6min,260.6±41.6min,60.7±16.9min;药时曲线下面积分别为672.6±86.6μg/L*min,1324.9±175.3μg/L*min,2191.8±256.3μg/L*min,700.1±122.3μg/L*min。(10)45mg/kg的脂质体b FGF和b FGF静脉注射后,小鼠无一例死亡,且生活状态良好,雄性小鼠两个实验组体重呈现持续增长状态,与空白对照组相比,均无显著性差异(P0.05);而雌性小鼠b FGF给药组的体重在给药后的第一周几乎没有增加,在第二周过后又恢复正常。(11)各脏器HE染色结果与空白组相比,均未见有显著意义的病理学改变。(12)6-OHDA处理后,细胞的存活率降低,50~100μM的6-OHDA对细胞几乎没有影响,150,200,250和300μM的6-OHDA诱导后,细胞的存活率分别为16%,40%,52%和61%,100 ng/ml,500 ng/ml和1000 ng/ml的b FGF预处理组细胞存活率明显上调。(13)超微水平观察细胞形态学,200μM的6-OHDA能够损伤SH-SY5Y细胞,使其严重变形,破裂,细胞质外泄,轴突变短,而b FGF预处理过的细胞则能够对抗6-OHDA所产生的毒性,改善细胞的形态,维持细胞结构的完整性。(14)6-OHDA能够减少微管蛋白和突触蛋白的表达,上调CK-1和PLK-2,增加SY-SY5Y细胞内α-syn Ser129位点和tau Ser 396位点的磷酸化,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);b FGF能够增加tubulin,α-syn和DCX的表达,降低SY-SY5Y细胞内α-syn Ser129位点和tau Ser 396位点的磷酸化,下调CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信号通路(p0.05)。结论:(1)体内外实验均证明,b FGF在6-OHDA诱导的PD模型中具有神经保护作用。(2)b FGF通过下调α-syn Ser129位点磷酸化和tau蛋白Ser 396位点的磷酸化来减少6-OHDA引起的神经毒性。(3)b FGF通过下调CK-1的表达从而减少α-syn Ser129位点磷酸化;b FGF通过激活PI3K/AKT/GSK-3信号通路来调控tau蛋白Ser 396位点的磷酸化。(4)脂质体能够帮助b FGF延长半衰期,使其消除速率减慢;同时增加b FGF在大脑皮质和纹状体内的分布。(5)脂质体b FGF和b FGF对小鼠的最大耐受剂量大于45mg/kg,且对大鼠鼻黏膜,嗅球,黑质纹状体,肝脏和肺均无病理学的损伤作用。
[Abstract]:Objective: To study the effect of basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, B FGF) in 6- (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) of 6-hydroxydopamine induced Parkinson (Parkinson 's disease, PD) model in rats, and explore its mechanism. At the same time to evaluate the pharmacokinetics and safety of B FGF, provide the theoretical basis for the clinical treatment of Parkinson, the route of Administration for the B FGF to provide safe and effective. Methods: (1) by stereotaxic system 6-OHDA was injected into the striatum of SD rat model was made by liposome and intranasal administration of B FGF (delivered into the brain. 2) behavior (rotation experiment, gait analysis experiment and field test was used to detect the effect of B FGF) and B FGF liposome on PD model induced by 6-OHDA. (3) the electrochemical liquid chromatography (HPLC-ECD) detection in the rat striatum neurotransmitters DA and its metabolic products 鐗〥OPAC鍜孒VA娴撳害.(4)鍏嶇柅缁勫寲娉曞拰鍏嶇柅鍗拌抗娉曟��娴嬬汗鐘朵綋鍜岄粦璐ㄥ唴TH鐨勮〃杈，

本文编号：1456393