磺酸基转移酶在肝细胞癌中的变化及其对药物代谢处置的影响

发布时间：2018-01-24 07:13

  本文关键词： 肝细胞癌 磺酸基转移酶 Isotope Label-free UHPLC-MS/MS 蛋白定量 个体化治疗　出处：《南方医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景和目标肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是临床上最常见的高致死率,高发性恶性肿瘤。研究由HBV诱发的肝细胞癌中肝药酶的基因和功能性的改变,从中掌握其变化规律,可为肝癌治疗的合理用药以及肝癌的早期诊断提供帮助。磺酸基转移酶(Sulfotransferases:SULT),作为肝脏中主要的二相药物代谢酶,涉及了易诱发癌症物质的激活和灭活过程。HCC状态下SULTs酶活性和表达的改变会导致难以预测药物对肿瘤的疗效及其对周围组织的毒副作用。本研究拟检测HCC肿瘤组织中SULTs酶活性、蛋白含量及mRNA表达水平的改变及其相关性,以白藜芦醇为例探讨HCC患者中SULTs酶活性改变对药物代谢的影响,为临床合理用药提供参考。二、研究方法1:非同位素标记液相与质谱联用方法(Isotope Label-free UHPLC-MS/MS)和蛋白免疫印迹方法(Western-blot)定量正常人肝组织S9(肝匀浆液的去线粒体上清液,包含了大量药物代谢酶)中5种SULTs酶的蛋白表达。2:①差速离心法制备癌旁及HCC肿瘤组织S9蛋白。LC-MS/MS方法绝对定量5种SULTs酶在癌旁及HCC肿瘤组织S9中的蛋白含量。②底物探针方法评价SULTs酶活性。③采用Real-Time PCR方法研究SULTs酶mRNA表达水平。三、实验结果1.相比较Western-blot,LC-MS/MS分析方法有更好的专属性和敏捷性为了验证分析方法的专属性,分别运用LC-MS/MS和Western-blot方法同时分析人源重组化SULTs蛋白。结果显示,Westem-blot中只有40%抗体具有专属性且整个实验耗时达24小时以上,而LC-MS/MS方法专属性达到100%,耗时仅6个小时且完成一次样品分析时间不超过10分钟。2.在正常人肝组织S9中,SULTs酶蛋白定量和相关性分析分别运用LC-MS/MS和Western-blot方法定量正常人肝组织S9中的5种SULTs酶蛋白表达。相关性分析显示,除了 SULT1A3(r2=0.492)和SULT2A1(r2= 0.546),其他 SULTs 酶(SULT1A1、SULT1B1 和 SULT1E1)相关性都良好(r20.6,分别为 0.899、0.764 和 0.691,P0.05)。3.HCC肿瘤组织中SULTs酶蛋白含量变化用建立的LC-MS/MS方法首次绝对定量上述5种SULTs酶在正常人肝组织、癌旁和HCC肿瘤组织中的蛋白含量。结果显示,SULT1A1在70%肿瘤组织中的蛋白含量显著降低,SULT1B1在20%肿瘤组织中的蛋白含量显著降低,SULT1A3在50%肿瘤组织中的蛋白含量显著降低,SULT1E1在40%肿瘤组织中的蛋白含量显著降低,SULT2A1在70%肿瘤组织中的蛋白含量显著降低。并且,SULTs酶的蛋白含量具有很强的个体差异性。4.HCC肿瘤组织中SULTs酶活性及其对白藜芦醇代谢处置变化运用底物探针方法系统地评价SULTs酶在混合的正常人肝组织S9、癌旁和HCC肿瘤组织S9中的代谢活性。结果显示,HCC肿瘤组织S9中上述5种SULTs酶大部分对探针底物的代谢速率均显著降低(SULT1A3和SULT1B1除外)。另外,SULTs酶在肿瘤组织S9中的催化能力(TONs)均与正常和癌旁组织S9无显著性差异(SULT1A1除外)。个体研究显示,SULT1A1在100%肿瘤组织S9中的酶活性显著降低,SULT1B1在20%肿瘤组织S9中的酶活性显著降低,SULT1A3在30%肿瘤组织S9中的酶活性显著降低,SULT1E1在50%肿瘤组织S9中的酶活性显著降低,SULT2A1在80%肿瘤组织S9中的酶活性显著降低。另外,在HCC肿瘤组织S9中白藜芦醇的灭活速率会显著性降低。个体研究显示,在个别HCC肿瘤组织S9中白藜芦醇磺酸化代谢产物的生成速率远大于正常和癌旁组织S9。5.HCC肿瘤组织中SULTs酶mRNA表达水平变化相比较于癌旁组织,SULTs酶mRNA表达水平在90%以上肿瘤组织样品中显著下调90%以上(SULT1B1除外),并且个体差异的现象尤为突出。6.SULTs酶蛋白含量与代谢活性的变化及其对白藜芦醇代谢处置的相关性结果显示,癌旁和HCC肿瘤组织S9中SULTs酶活性与其蛋白含量具有较强相关性(r20.6,SULT1A3除外),而与mRNA表达水平相关性较弱。白藜芦醇在体内的代谢由SULTs酶的参与。相比较于癌旁组织,白藜芦醇在HCC肿瘤组织S9中的代谢速率与SULT1A1的酶活性及蛋白含量相关性更加显著(r20.6)。四、结论SULTs酶蛋白含量下调会引起HCC肿瘤组织S9中SULTs酶活性显著降低,而酶蛋白分子催化能力并未显著改变。同时,本研究建立了一种快速、灵敏和准确的LC-MS/MS方法可同时测定正常人肝组织S9,癌旁和HCC肿瘤组织S9中SULTs酶蛋白绝对含量;并以白藜芦醇为例探讨HCC患者中SULTs酶活性改变对药物代谢处置的影响,可为临床合理用药提供方法学的参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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本文编号：1459472