震波治疗通过调节细胞自噬减轻缺氧导致的H9c2细胞损伤

发布时间：2018-01-24 20:38

  本文关键词： 心肌细胞缺氧 自噬 震波治疗 AMPK/mTOR　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:尽管近年来针对冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)的药物治疗、介入治疗(PCI)和外科手术治疗(CABG)取得了很大进展,仍有部分严重冠心病患者不能耐受PCI或CABG治疗,或已经接受以上治疗后仍有心绞痛症状反复发作。这类患者仅依赖单纯的药物治疗,预后差,死亡率高。体外心脏震波治疗是近年来针对严重冠心病患者的新的治疗手段,目的是改善心肌供血和心脏功能。震波发挥心脏保护作用的机制尚不甚明确,可能包括促进内皮祖细胞的归巢、刺激血管新生和抑制氧化应激、炎症和纤维化等。我们前期的细胞实验和动物实验均证实震波治疗可减轻缺血缺氧所致的心肌细胞凋亡,保护心脏功能。自噬是真核细胞特有的、能够对细胞内的损伤蛋白和细胞器进行降解并重新利用的过程,可实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新,在多种应激和疾病中发挥重要作用。近年来,越来越多的研究证实自噬参与多种心血管疾病的发生和发展,但其究竟发挥正面或是负面作用,仍存在争议。但有研究发现轻中度的缺血缺氧诱导的心肌细胞自噬可能是保护性的,而震波治疗能否通过影响自噬发挥心脏保护作用,目前尚无相关研究数据。研究目的:我们利用大鼠心肌细胞系H9c2(1)通过选择合适的缺氧培养条件,建立心肌细胞体外缺血缺氧模型,探讨缺氧时自噬发生的情况及其作用;(2)选择作用于缺氧心肌细胞的震波治疗所需合适能量;(3)探讨震波治疗在缺氧损伤中对心肌细胞自噬的影响和其发挥作用可能的信号通路。研究方法:(1)H9c2细胞在填充有92%N2、5%C02和3%02的三气培养箱中培养一定的时间后,测定细胞活性和细胞内ATP水平以评价细胞损伤的程度;Western blot法检测LC3B的表达水平,用LC3B-I/II评价自噬发生的强度。选择中等强度细胞损伤且自噬发生较强的缺氧培养时间。(2)缺氧后,分别予细胞相对较低(0.02mJ/mm2)、中(0.05mJ/mm2)和高(0.10mJ/mm2)三种强度的震波治疗,测定细胞活力和LC3B表达情况,选择对细胞活力和自噬强度影响最显著的震波能量。(3)用MDC法对自噬小泡进行染色,进一步验证震波治疗对缺氧心肌细胞自噬水平的影响;测定震波治疗前后细胞内ATP水平的变化,探讨震波治疗对细胞内能量代谢的影响。(4)Western blot的方法测定震波治疗对自噬相关主要信号通路蛋白(AMPK、mTOR和Beclin-1等)和细胞存活相关蛋白(Sirt1和HIF-1α)的表达情况的影响。研究结果:(1)缺氧处理后,H9c2细胞活力和ATP水平随着缺氧时间延长逐渐降低,自缺氧6小时开始,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值开始增强,24小时达高峰,此后随着缺氧时间的延长,该比值逐渐呈下降趋势。(2)震波治疗尤其是相对中等强度的震波(0.05 mJ/mm2)能够显著改善缺氧组的细胞活力,且使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,即缺氧诱导的细胞自噬水平被进一步增强;而对照组的细胞活力在三种强度的震波治疗前后均未见明显变化,较低(0.02 mJ/mm2)或较强(0.10 mJ/mm2)能量的震波均未对自噬水平产生有统计学意义的影响。(3)缺氧24小时后细胞内自噬小泡的荧光强度明显较对照组增强,给予震波治疗(0.05mJ/mm2)后荧光进一步增强。检测震波治疗前后细胞内ATP水平的变化,发现经震波治疗后,缺氧所致的ATP水平下降可较前明显回升。(4)缺氧后,H9c2细胞内磷酸化AMPK、Beclin-1和HIF-1α表达上调,而磷酸化mTOR和Sirt1下调。震波治疗可进一步增强磷酸化AMPK的上调和磷酸化mTOR的下调,增强Sirt1的表达增加,降低HIF-1α的表达。研究结论:(1)缺氧培养24小时能够造成H9c2细胞损伤、功能障碍和死亡;(2)缺氧导致心肌细胞自噬上调,表现为LC3B-II/LC3B-Ⅰ比值增加和细胞内自噬小泡数量明显增加;(3)能量为0.05mJ/mm2的震波治疗能够进一步提高缺氧诱导的心肌细胞自噬水平,减轻心肌细胞损伤,改善能量代谢,保护心肌细胞功能;(4)震波治疗可能通过影响AMPK/mTOR信号通路促进缺氧诱导的心肌细胞自噬,可能通过Sirt1和HIF-1α通路促进细胞存活,发挥心脏保护作用。
[Abstract]:In recent years , we have studied the effects of shock wave therapy on myocardial cell apoptosis and protecting heart function . ( 4 ) The effects of shock wave therapy on the expression of autophagy - related protein ( AMPK , mtor and Beclin - 1 , etc . ) and cell survival - related proteins ( Sirt1 and HIF - 1伪 ) were measured by Western blot . Results : ( 1 ) After hypoxia treatment , the activity and ATP levels increased gradually with the increase of hypoxia time . ( 4 ) After hypoxia , the expression of phosphorylated AMPK , Beclin - 1 and HIF - 1伪 was regulated .

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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本文编号：1460959