神经系统疾病免疫干预的研究

发布时间：2018-01-27 04:04

本文关键词： 缺血性脑卒中芬戈莫德 S1PR调节剂视神经脊髓炎谱系疾病神经干细胞 CFHR1　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:神经系统炎症的发生存在两种激活模式,在经典的神经免疫疾病中,获得性免疫反应首先在外周被激活,然后靶向中枢神经系统的抗原,引起疾病的发生,这是神经系统免疫反应激活的经典途径。另一种模式是中枢神经系统的稳态首先受到破坏,然后再激活免疫系统的反应。本研究旨在探讨经典的神经免疫系统疾病以及脑血管病中,脑内免疫炎症的发生机制以及相应的干预策略。Fingolimod是一种鞘氨醇1-磷酸受体(sphingosine 1-phosphate receptor,S1PR)调节剂,是第一个美国FDA批准用于临床治疗复发缓解型多发性硬化的口服药物。前临床研究显示,fingolimod可以减轻缺血性脑卒中动物模型的脑损伤;在一个概念性临床研究中,fingolimod用于治疗急性缺血性脑卒中患者的安全性和有效性得到了初步证实。然而,在将S1PR调节剂进一步推向临床前,有一些问题需要进一步明确,这些问题包括:(1)如何避免S1PR调控的心脏副作用;(2)S1PR调控的非淋巴细胞依赖的机制;(3)S1PR调节剂用于减轻脑缺血急性损伤的时间窗尚未明确,而且不同类型的脑卒中对于S1PR调节剂的反应性也不明确。RP101075是第二代的S1PR调节剂,可以选择性激动S1PR1。RP101075半衰期短,可以很快分布至脑内,心脏副作用明显减轻。本研究将研究RP101075对于缺血性脑卒中的作用,并通过明确其治疗时间窗,应用多种不同的动物模型,来提高本研究的转化价值。本研究将进一步明确S1PR1调节对于缺血性脑卒中的治疗机制。第二部分:视神经脊髓炎谱系疾病是一种主要累及脊髓和视神经的炎性脱髓鞘疾病,其病程较多发性硬化进展更快,致残率更高,在亚洲的发病率高于欧美,主要发病人群是青年女性。视神经脊髓炎最主要的病理特点是补体成分和Ig G在病灶部位沉积,造成星形胶质细胞的损伤,继而发生脱髓鞘。补体系统的激活在视神经脊髓炎的病理改变中起了重要作用。干细胞具有不断自我更新以及分化的能力,使得干细胞移植成为再生医学中治疗一些严重疾病的重要选择。然而病灶部位的炎症微环境是阻碍干细胞移植修复损伤组织的关键因素。在本研究中我们试图探索神经干细胞进行视神经脊髓炎谱系疾病修复治疗的策略。方法:在本研究中我们应用了多种不同的小鼠脑缺血动物模型,包括阻断不同时间(30 min,60 min,90 min)的大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,以及光化学法皮层梗塞模型。RP101075通过灌胃给予小鼠,剂量0.6mg/kg,每日一次。梗死灶大小通过2,3,5—氯化三苯基四氮唑(TTC)染色或者核磁来计算,神经功能缺损评分通过m NSS评分评价。首先我们检测了不同剂量的RP101075以及不同的给药频率对于60min MCAO脑梗死灶大小以及神经功能缺损评分的影响,然后明确了在三次给药后治疗效果是否可以持续到第7天。我们通过延迟开始给药时间至不同的时间点,来明确RP101075对于急性脑缺血损伤的治疗时间窗。通过观测RP101075对于不同梗死类型小鼠的效果,我们来评价不同梗死类型对于S1PR1调节的反应性。对于机制研究,首先我们通过评价Rag2-/-gc-/-小鼠脑缺血后对于RP101075治疗的反应来明确S1PR调节对于脑缺血的治疗效果是否依赖于对外周淋巴细胞的调节。通过质谱-液相色谱仪检测了给药后药物在脑内和外周血的分布。流式细胞术用来检测外周血和脑内的淋巴细胞亚群数量。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)用来检测不同脑区的炎症因子浓度来明确脑内的炎症水平。Western blot用于检测脑内渗出的血浆蛋白纤维蛋白原的量来评价血脑屏障破坏程度。进一步我们通过免疫组化的方法分析了脑内微血管中纤维素和血小板的沉积,以及微血管结构收缩的情况来明确RP101075的作用机制。在第二部分研究中:实验性视神经脊髓炎小鼠动物模型的建立,我们通过给小鼠脑内立体定位注射纯化的抗水通道蛋白4(AQP4)抗体强阳性的视神经脊髓炎(NMO)患者的血清Ig G(NMO-Ig G)和人补体(h C),在小鼠脑内模拟NMO样病灶。分离胎鼠脑皮层获得神经干细胞(NSCs),然后用补体因子H相关蛋白1(CFHR1)修饰NSCs(CFHR1-NSCs)以GFP空载体修饰的NSC为对照(GFP-NSCs)。将CFHR1-NSCs和GFP-NSCs分别移植入小鼠脑内,在第7天通过7T MRI(T2WI和T1WI+Gd-DTPA)以及免疫荧光检测小鼠脑内病灶的大小、渗出以及炎症细胞的侵润和膜攻击复合物(MAC)的沉积。在体外,我们用分离的原代小鼠星形胶质细胞来进一步验证CFHR1-NSC的治疗机制,向培养的原代星形胶质细胞以及诱导神经干细胞分化而来的星形胶质细胞培养基中加入NMO-Ig G和h C在体外模拟NMO病理环境,然后用含有CFHR1的培养基替代原培养基。通过检测LDH以及免疫荧光观察细胞的破坏程度和形态的改变。结果:我们发现,RP101075可以减小C57BL/6小鼠脑缺血后梗死灶的大小并改善神经功能缺损评分,其治疗效果具有剂量依赖性而不依赖于给药频率。RP101075在缺血后12小时内给药可以抑制梗死灶的扩大,而在24小时给药可以减轻脑水肿的发展并改善神经功能评分。RP101075对于不同梗死灶大小和梗死位置的小鼠具有相似的治疗效果。RP101075在给药后12小时可以明显的富集于脑内,RP101075可以抑制淋巴细胞向脑内的浸润和脑内局部的炎症反应,但其治疗效果并不完全依赖于对外周免疫的调控。RP101075增加了血脑屏障的完整性以及脑内微血管结构的通畅,保护了脑缺血后微循环的功能。在第二部分中:我们构建的CFHR1-NSCs可以稳定合成并分泌CFHR1,而其增殖和分化能力与神经干细胞相比并不受影响,而且由CFHR1-NSCs分化而来的星形胶质细胞仍然可以稳定分泌CFHR1。与模型对照组相比,GFP-NSCs并不能抑制MRI上病灶的扩大和对比剂的渗出,AQP4、GFAP和髓鞘的脱失以及炎症细胞的侵润、激活,和MAC的沉积,而移植CFHR1-NSCs的小鼠脑内的病灶明显比模型组和GFP-NSCs移植组小,对比剂渗出减少,炎症细胞的侵润和激活以及MAC的形成明显受抑制,保护了星形胶质细胞和髓鞘,移植的CFHR1-NSCs向星形胶质细胞分化以修复病灶,并保护了内源性星形胶质细胞免受NM-Ig G和h C的攻击。体外实验表明:原代星形胶质细胞,以及NSCs和GFP-NSCs分化而来的星形胶质细胞均可被NMO-Ig G和h C破坏,而CFHR1-NSCs分化的星形胶质细胞不受影响。当我们给CFHR1-NSCs分化的星形胶质细胞更换新的培养基后,NMO-Ig G和h C可对其造成破坏,此外,CFHR1-NSCs的培养上清可以保护原代星形胶质细胞不被NMO-Ig G和h C破坏,验证了体内实验的结果。结论:RP101075,做为新一代的S1PR调节剂,具有优良的的药代动力学特点和安全性,可以减少淋巴细胞向脑内浸润并保护脑内微循环的完整性和功能。S1PR1调节剂可作为缺血性脑卒中安全的潜在治疗方式。干细胞具有向病灶部位趋化的特性,其在修复损伤的同时,更是一个理想的载体。我们通过补体抑制基因修饰神经干细胞使其可以在病灶部位合成并分泌CFHR1,从而特异性地调控局部的炎症微环境,促进外源性及内源性的神经修复。为促进神经系统自身免疫性疾病细胞替代疗法的有效性提出了新的方案和理念。
[Abstract]:Objective : To study the effect of S1PR regulator on ischemic stroke . In the second part , we evaluated the effects of RP1010 - 75 on the size of cerebral blood and peripheral blood . We evaluated the effects of RP1010 - 75 on brain and peripheral blood by observing the effects of different doses of RP1010 75 on cerebral ischemia - reperfusion . In vitro experiments have shown that the astrocytes , and the astrocytes of CFHR1 - can be destroyed by NMO - Ig G and h C . The results of experiments in vivo have been verified .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R741

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