发热伴病毒调控细胞因子网络及Ⅰ型干扰素信号通路的研究

发布时间：2018-01-27 04:18

本文关键词： 发热伴血小板减少综合征细胞因子风暴病毒复制 Ⅰ型干扰素信号通路　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种新发的自然疫源性疾病。该种疾病的主要临床表现是急性发热、白细胞和血小板减少、消化道症状和神经系统症状等。该病病原体为发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),简称发热伴病毒,于2009年被于学杰教授团队首次分离发现。随后韩国和日本也相继报道了 SFTSV实验室确诊感染病例。此外,在美国跟印度亦发现了与SFTSV感染类似的病例,其病原体分别被命名为Heartland病毒和Malsoor病毒,这两种病毒的基因与SFTSV高度同源。由此可见,SFTSV作为一种新发现的病毒在全球分布范围广泛。SFTS疾病病死率较高,目前已有文献报告的最高病死率在30%左右。鉴于其分布广泛且病死率较高,对该种疾病的及时临床诊断和转归预测分析变得尤为重要。既往研究证实,病毒感染会导致机体细胞因子水平紊乱。感染登革热病毒后,在出现了出血热综合征的重症病人血清中,TGF-1β和IL-8的含量显著高于普通感染者。在致病性Ebola病毒感染者血清中,IFN-γ水平显著升高,IL-2、IL-10、IFN-α等细胞因子水平也有不同程度的升高。既往研究中SFTS病人血清细胞因子含量检测结果不尽相同:研究发现SFTS病人血清中某些细胞因子,如TNF-α、G-CSF、IL-6、IL-10、IFN-γ等含量高于健康人群。然而也有研究发现SFTS病人血清中IFN-γ、RANTES、PDGF等细胞因子含量低于健康人群。Ⅰ型干扰素是机体固有免疫应答过程中关键的细胞因子,体外研究发现SFTSV的NSs蛋白能够抑制Ⅰ型干扰素通路信号传导,但目前针对SFTS病人血清中Ⅰ型干扰素含量的检测甚少,因此十分有必要对SFTS病人急性期血清细胞因子,尤其是Ⅰ型干扰素的浓度进行全面准确的检测,以探寻SFTSV感染对机体内细胞因子的调控机制,分析发热伴病人血清细胞因子浓度与病情严重程度之间的关系,从而为进一步深入了解SFTSV的致病机制提供线索和依据。既往研究发现SFTS病人血清某些细胞因子含量比健康人高,如TNF-α、G-CSF、IL-6、IL-10 等。重症病例血清 G-CSF、IL-6、TNF-α、IL-10 等细胞因子含量显著高于轻症病例。死亡病例血清细胞因子G-CSF、TNF-α含量显著高于存活病例,这说明过度表达的细胞因子会影响疾病病情及转归。既往研究发现SFTS病人血清细胞因子含量与体内病毒载量呈正相关,我们怀疑细胞因子的过度表达会对机体的免疫反应产生负向调控,影响病毒在机体内的复制和清除,进而影响疾病病情。作为一种新发传染病,SFTSV发病机制尚未完全阐明。体外实验研究发现,病毒的NSs蛋白可以与Ⅰ型干扰素信号通路上的IRF3、TBK1相互作用,通过与这些信号分子的相互作用,将其"劫持"进入病毒感染诱导形成的细胞胞质囊泡中,使得这些信号分子功能受到抑制,影响Ⅰ型干扰素信号途径传导。然而目前有关SFTSV对Ⅰ型干扰素信号转导的研究多局限于单一信号分子。病毒感染与机体防御之间的博弈是一个极其复杂的过程,想要了解SFTSV的致病机制就需要对病毒调控Ⅰ型干扰素通路的过程有详细全面的了解。此外,研究发现在发热伴病毒感染Vero细胞和HEK293细胞时,病毒的非结构蛋白能够和核蛋白以及病毒RNA互相作用,这说明NSs蛋白可能参与了 SFTSV的复制过程。既往研究证实,用黄热病毒NS1蛋白免疫恒河猴后再接种致死剂量病毒时,可显著降低实验动物死亡率。接种日本森林脑炎病毒NS1 DNA疫苗可有效的降低该病毒感染导致的小鼠死亡率。虽然已有研究证实用重组的NSs蛋白免疫小鼠并不能有效的清除小鼠体内的SFTSV,但鉴于原核表达的重组蛋白仅保留了线性表位,本研究旨在用NSs蛋白的真核表达质粒免疫小鼠,检测其对病毒的清除作用,以评价其对小鼠潜在的保护能力。研究目的1、检测SFTS病人急性期血清中细胞因子含量,检测细胞因子风暴存在与否,分析细胞因子含量与疾病病情的关系。2、通过建立乳鼠的发热伴病毒感染模型,分析各类细胞因子对机体内SFTSV复制和清除的影响,为深入研究SFTSV的致病机制提供科学依据。3、通过建立小鼠感染SFTSV模型,分析病毒感染后Ⅰ型干扰素信号通路相关基因表达谱的改变,为全面探讨SFTSV的发病机制提供科学依据。4、构建SFTSVNSs蛋白真核表达质粒并评价其对小鼠潜在的保护能力。研究方法1、采用流式液相多重蛋白定量技术检测SFTS病例组和健康对照组人群血清中细胞因子含量。按照病例组VS对照组,重症病例VS轻症病例的分组方式,分析各组人口特征(性别、年龄)及细胞因子含量的差异。2、建立BALB/c乳鼠感染SFTSV的动物模型,腹腔注射不同剂量细胞因子,通过荧光定量PCR方法检测乳鼠体内病毒载量和抗病毒相关因子表达,组织切片染色查看组织损伤。3、建立BALB/c小鼠感染SFTSV模型,运用基因芯片检测小鼠Ⅰ型干扰素信号通路相关基因表达谱的改变。4、构建SFTSVNSs蛋白真核表达质粒(PVAX-NSs),以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠后腹腔接种病毒,采取荧光定量PCR的技术测定组织中病毒载量,采取ELISA法测量小鼠血清内干扰素浓度,基因芯片检测Ⅰ型干扰素信号通路相关基因表达。5、统计分析方法:所有资料利用Microsoft Office Excel 2007进行数据录入。数据分析采用SPSS18.0分析软件。正态分布定量资料采用均数±标准差的形式描述,两样本均数差异的比较采用独立样本t检验。多组样本均数差异比较采用方差分析:满足方差齐性检验时采用Bonferroni法,不满足方差齐性检验时采用Dunnett'sT3法。非正态分布定量资料采用中位数(四分位数间距)的形式描述,差异比较采用非参数检验-Kruskal-Wallis秩和检验。定性资料采用构成比形式描述,分析时采用卡方检验。P值小于0.05为差异有统计学意义。研究结果1、血清细胞因子检测结果1.1 SFTS病例组与对照组的人口特征(性别、年龄)无差异(P0.05)。本研究共检测10种细胞因子,分别为:TNF-α、IFN-γ、IFN-α、G-CSF、IL-10、IL-6、RANTES、MIP-1α、IP-10 及 MCP-1。除 RANTES 外,病例组与健康对照组血清中各细胞因子含量均有差异,病例组血清内各类细胞因子浓度均比健康对照组高(P＜0.05)。1.2 SFTS重症病例组与轻症病例组性别分布无差异,但重症病例年龄显著高于轻症病例(P0.05)。重症病例血清 IFN-γ、IFN-α、G-CSF、MIP-1α、H-6 和IP-10含量高于轻症病例(P0.05)。2、细胞因子对SFTSV复制和清除的影响2.1已感染SFTSV的BALB/c乳鼠腹腔注射细胞因子后,注射高剂量IFN-α的乳鼠体重明显轻于对照组和低剂量组(P0.05)。2.2 IFN-α、MIP-1α或IFN-γ处理组乳鼠肝脏组织病毒载量比对照组高(P0.05)。2.3 IFN-α、MIP-1α或IFN-γ处理组乳鼠脾脏组织病毒载量高于对照组(P0.05)。2.4与对照组相比,IFN-α、MIP-1α或IFN-γ处理组乳鼠脾脏组织抗病毒相关基因表达发生改变:除SOCS1外,IRF3、STAT1、NF-κB、CXCL10表达均有不同程度下降。3、基因芯片检测发现病毒感染后机体Ⅰ型干扰素信号通路相关基因表达发生改变。其中 CAV1、CD86、H2-BL、IFITM1、MAL、PRKCZ、TLR8、IFNB1、IFNA4 等基因表达明显下降;而 IL10、EIF2AK2、IFIT1、IRF7、ISG15、OAS2、MX1等基因的表达显著升高。4、PVAX-NSs真核质粒免疫BALB/c小鼠可刺激机体产生相应抗体,可在一定程度上拮抗NSs对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制,但未能有效清除小鼠体内的病毒。结论1、通过比较SFTS病人和对照人群血清中细胞因子含量,证实了 SFTSV感染可导致机体出现细胞因子风暴。通过分析不同病情SFTS病人血清中细胞因子含量,证实因子风暴和SFTS病情的严重程度相关,提示细胞因子风暴可预测SFTS疾病进程和预后情况。2、通过乳鼠感染模型证实过量细胞因子会导致机体免疫功能负向调节,影响抗病毒基因的表达,进而影响病毒的复制和清除。3、SFTSV病毒感染影响Ⅰ型干扰素信号通路相关基因表达。4、NSs真核表达载体免疫未能给BALB/c小鼠提供有效的保护。意义和创新1、本研究证实SFTSV感染可导致机体出现细胞因子风暴,发现SFTS病情与细胞因子风暴有关,提示保持机体免疫稳态在改善疾病预后和转归中十分关键。2、现过量细胞因子会对机体SFTSV感染产生影响,为临床治疗和深入研究疾病发病机制提供了科学依据。3、首次通过表达谱基因芯片全面分析了 SFTSV感染对Ⅰ型干扰素通路信号转导的影响,为深入了解疾病发病机理建立了基础。4、证实NSs质粒免疫刺激机体产生的抗体不能有效的清除病毒,但可以在一定程度上拮抗NSs蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.8

【参考文献】