TRPV1参与瘙痒形成及蛇床子素止痒机制研究

发布时间：2018-02-02 09:02

本文关键词： 痒 TRPV1 组胺依赖性痒慢性痒蛇床子素　出处：《南京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的:痒是区别于痛的不愉快感觉,会引起机体搔抓的欲望。痒不仅是临床各种皮肤病的常见症状也是系统性疾病的伴随症状。日常生活中,蚊虫叮咬、接触过敏原、服用药物等均能导致瘙痒的发生。而瘙痒经久不愈,多伴有抑郁、失眠、焦虑等症状。可以说,瘙痒做为一种常见的疾病,不仅严重影响人们的日常生活,也严重影响人们的生活质量。但目前瘙痒的机制还不清楚,临床也缺乏有效的止痒药物。TRPV1是瞬时开放的非选择性的阳离子通道,能够被热(43℃)、弱酸、辣椒素及一些内源性的配体激活。TRPV1在疼痛的起始和传导中起重要作用。但现在越来越多的研究发现:TRPV1在瘙痒中扮演着重要的角色。比如:TRPV1在组胺依赖性痒中起到重要作用。首先,TRPV1与组胺受体在背根神经节(DRG)神经元上共表达,大多数能被组胺激活的神经元也能被辣椒素激活;其次,在TRPV1-1-小鼠或应用TRPV1阻断剂时能明显抑制组胺依赖性痒;最后,激活DRG组胺H1受体可通过磷脂酶C(PLC)β3打开TRPV1离子通道,使神经元兴奋,传导痒觉信号。但是组胺除了 H1受体外还有一个重要的痒相关受体-H4受体。TRPV1在组胺H4受体介导的急性痒中的作用并不清楚,而且TRPV1是否参与慢性痒也不清楚。研究发现慢性痛与慢性痒的界限在病理条件下是模糊的,慢性痒条件下,在正常情况下会导致疼痛的有害刺激反而会引发更加明显的瘙痒,但是这种现象是如何产生的并不清楚。在疼痛与瘙痒中都起到重要作用的TRPV1,在有害刺激下,痛感觉向痒感觉转化的过程中扮演了什么样的角色都是有待研究的问题。中药蛇床子Cnidium monnieri(L.)Cuss为一年生伞形科植物蛇床的干燥成熟果实,具有温肾壮阳,祛风燥湿和杀虫止痒的功效。在对古今中医痒相关方剂进行筛选时发现:中药蛇床子长期被用于治疗多种瘙痒症,疗效显著。蛇床子的醇提液能有效抑制P物质和皮炎模型诱导的搔痒行为。而蛇床子中含量最高的香豆素成分-蛇床子素,对48/80化合物诱导的急性痒和二硝基氯苯(DNCB)诱导的慢性痒具有抑制作用。这提示我们蛇床子素可能对组胺依赖性痒有效,但是蛇床子素的止痒机制是什么并不清楚,作为痒觉信号通路下游的TRPV1通道是否是蛇床子素止痒的靶点都有待研究。因此,本研究目的主要有以下几点:1.研究TRPV1在组胺H4受体介导的急性痒中的作用。2.研究TRPV1离子通道是否参与慢性瘙痒及在慢性痒形成过程中的功能,探讨慢性痒条件下痛刺激-痒行为转换的机制。3.研究蛇床子素的止痒机制及TRPV1在其中的功能。实验方法:第一章的实验研究中,利用野生型小鼠急性培养的DRG神经元,通过钙成像实验研究组胺H4激动剂immepip对神经元的作用,及G蛋白偶联受体(GPCR)、PLC通路、TRPV1离子通道、TRPA1离子通道的阻断剂对immepip引起的神经元兴奋性的影响;通过行为学实验研究PLC通路和TRPV1离子通道阻断剂是否影响immepip介导的搔痒行为。在第二章的实验研究中,利用AEW(丙酮/乙醚和水)模型模拟慢性瘙痒症-干皮症,利用野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠研究AEW造模后皮下注射辣椒素的疼痛行为和搔痒行为的变化。利用TRPV1-PLP+/-转基因小鼠进行碱性磷酸酶染色,观察TRPV1在皮肤及三叉神经节(TG)上的表达变化;应用荧光实时定量PCR技术和免疫印迹法(WB)检测小鼠AEW造模后TRPV1在TGs中的mRNA水平和蛋白水平;在钙成像实验中,利用Pirt-GCaMP3+/-小鼠研究在培养的TG细胞和分离得到的整个TG中,造模侧与对照侧神经元对辣椒素刺激的敏感性变化。在第三章的实验研究中,应用行为学实验研究蛇床子素的止痒效果;应用钙成像实验研究蛇床子素对组胺和组胺H1、H4受体激动剂HTMT、VUF8430引起的痒觉信号传导的影响;应用钙成像和全细胞膜片钳技术研究蛇床子素对TRPV1离子通道活性的作用。实验结果:1.通过钙成像实验发现在外周感觉神经元上,组胺H4受体激动剂immepip可以兴奋DRG神经元,且能和组胺、辣椒素激活同一神经元。而PLC通路的阻断剂U73122和TRPV1离子通道的阻断剂capsazepine/AMG9810能够抑制immepip对神经元的兴奋作用。虽然钌红能够阻断immepip引起的胞外钙离子内流,但是TRPA1的阻断剂HC-030031并无此作用,这表明TRPV1是组胺H4受体痒觉信号传导的下游离子通道。而行为学实验验证了这一点:PLC通路的阻断剂U73122和TRPV1离子通道的阻断剂AMG9810明显抑制了immepip引起的搔抓行为。2.利用AEW的造模方法,本研究模拟了慢性瘙痒模型-干皮症。而在行为学中还发现一个有意思的现象:AEW小鼠造模侧皮下注射辣椒素引起了搔痒行为的增加而疼痛行为不变。也就是说:在慢性痒条件下,辣椒素激活TRPV1使原本的疼痛刺激向痒行为转化。TRPV1-PLAP+/-转基因小鼠AEW造模染色后发现:TRPV1阳性纤维在造模侧皮肤密度增大,TRPV1阳性神经元在TG表达增多。荧光实时定量PCR和WB实验结果表明无论是TRPV1的mRNA水平还是蛋白水平在TG上的表达都明显上调。而钙成像实验则进一步发现AEW造模敏化了 TRPV1离子通道,对辣椒素刺激更加敏感。3.通过行为实验发现蛇床子素能够抑制组胺和组胺受体H1激动剂HTMT、组胺H4受体激动剂VUF8430诱导的搔痒,但是对8mM CQ诱导的非组胺依赖性痒无抑制作用。表明蛇床子素的止痒作用主要是针对组胺依赖性痒。在钙成像实验中,蛇床子素对组胺、HTMT、VUF8430引起的胞外钙离子内流都有抑制作用,表明蛇床子素并不是特异性的作用于组胺某一受体,而有可能是作用于组胺痒觉信号传导的下游。钙成像实验和全细胞膜片钳记录表明蛇床子素能够抑制辣椒素引起的钙离子内流和内向电流。也就是说蛇床子素可以抑制TRPV1离子通道的活性。实验结论:综上所述,通过行为学、钙成像及相关的分子生物学实验和电生理实验发现:TRPV1在瘙痒中起到重要作用。1.TRPV1和PLC通路参与组胺H4受体介导的急性瘙痒。2.在AEW慢性痒模型中,TRPV1的表达上调并敏化,可能是使辣椒素引起的痛刺激向痒感觉转换的原因。3.蛇床子素对组胺依赖性痒具有止痒作用,主要是通过调控TRPV1离子通道的活性实现的。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The itch is not only a common disease of various skin diseases , but also has an important role in the initiation and conduction of pain . In the second chapter , the effects of immepip on neurons were studied by means of calcium imaging . the expression up - regulation and sensitization of trpv1 may be the reason for the pain stimulus caused by capsaicin to the itch sensation conversion . 3 . osthol has an itch - relieving effect on histamine - dependent itching , mainly by regulating the activity of the TRL ion channel .

【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】