三阳血傣对多柔比星诱导的骨髓及心肌损伤的保护及机制研究

发布时间：2018-02-06 02:51

  本文关键词： 多柔比星 三阳血傣 骨髓抑制 心肌毒性 活性氧自由基 细胞凋亡 多柔比星 三阳血傣 p53 MAPK 凋亡　出处：《昆明医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分 SYKT对DOX诱导的骨髓抑制及心肌毒性的保护作用[目的]多柔比星(Doxorubicin, DOX)属于蒽环类细胞毒药物,广泛用于各种恶性肿瘤的治疗。但是它会引起严重的毒性反应,最常见的是出现骨髓抑制及心肌毒性。三阳血傣合剂(Sanyang Xuedai Mixture, SYKT)是来自于云南民间傣医“四塔五蕴”理论及选自《贝叶经》中传统方剂,由生姜、血竭、山药、甘草、茯苓、砂仁、三七、当归等八味中草药组成。相关研究显示SYKT有多种生物学功能。本研究将探讨SYKT是否能对DOX诱导的小鼠骨髓抑制及心肌毒性起到保护作用,并对其作用机制进行初步探讨。[方法]C57BL/6J小鼠分别给予DOX单药、SYKT单药及联合给药。通过检测外周血细胞、骨髓CD34+及CD44+细胞计数,检测细胞凋亡率来评估骨髓造血功能;通过检测血清心肌酶、细胞凋亡率及形态学观察来评估心功能,其中血清心肌酶指标包括天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase, AST)、肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH),通过全自动生化分析仪检测。通过流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率。通过HE染色及光学显微镜对心肌细胞形态学进行观察。通过FCM检测二氯荧光素强度来确定细胞内活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)水平。[结果]通过对DOX单药组小鼠的观测,发现生存率减低,外周血细胞及骨髓CD34+及CD44+细胞计数减少,骨髓细胞凋亡率升高,表现为明显骨髓抑制;另外血清心肌酶4项水平明显升高,心肌细胞凋亡率增加,通过观察心肌形态学发现细胞出现明显空泡变性、心肌纤维溶解断裂及单核巨噬细胞浸润,表现为明显的心肌受损及功能异常;然而联合SYKT治疗后以上指标均有不同程度好转,骨髓造血功能及心功能有所改善。此外,DOX单药组小鼠骨髓细胞及心肌细胞中ROS的水平均明显升高,且与细胞凋亡率成正比;而联合SYKT后细胞ROS生成减少,细胞凋亡率减低。另外,通过对荷瘤小鼠皮下移植瘤体积大小及肿瘤细胞凋亡率的检测证实SYKT在缓解骨髓抑制及心肌毒性的过程中并不影响DOX的抗肿瘤疗效。本研究结果提示SYKT可能通过抑制ROS介导的细胞凋亡来缓解DOX诱导的骨髓抑制及心肌毒性。[结论]研究结果显示SYKT可以缓解DOX诱导的小鼠骨髓抑制及心肌毒性,而且并未影响DOX的抗肿瘤疗效。作用机制主要是通过抑制细胞中ROS的生成,从而减少了骨髓及心肌细胞的凋亡。因此联合SYKT治疗可能成为DOX化疗中缓解患者骨髓抑制及心肌损伤的一种新的,安全有效的辅助治疗方法。第二部分 SYKT缓解DOX诱导的心肌毒性的作用机制[目的]尽管多柔比星(Doxorubicin, DOX)是一种广谱、有效的恶性肿瘤化疗药物,但因为常引起严重的心肌毒性而限制了它的临床应用。三阳血傣(Sanyang Xuedai Mixture, SYKT)被报道具有多种生物学功能。本研究的目的是探讨SYKT是否可作为一种有效的化疗辅助药物来逆转DOX诱导的心肌毒性;如果可以,那么它保护效应的分子生物学作用机制又是什么。[方法]离体培养小鼠原代心肌细胞,通过肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponin I,CTnI)的免疫荧光染色来明确心肌细胞纯度。通过western blot检测心肌细胞中p53、p38、JNK 的活化,其中将 PFT-α、SB203580、SP600125 作为 p53、p38、JNK的特异性抑制剂,设为SYKT的阳性对照。通过细胞胞浆线粒体分离提取试剂盒,提取线粒体,分别提取胞浆及线粒体蛋白,通过western blot检测心肌细胞胞浆及线粒体中Bax及细胞色素C的表达。通过罗丹明123染色及流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)或激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)检测心肌细胞线粒体膜电位的变化。通过western blot检测心肌细胞凋亡相关蛋白caspase-3及ADP核酸聚合酶(Poly ADP Ribose Polymerse,PARP)的表达。[结果]在小鼠心肌细胞中,DOX处理后引起前凋亡蛋白p53、p38、JNK活化,Bax转位,干扰线粒体膜电位,介导caspase依赖的凋亡信号途径,并引起心肌细胞凋亡。而联合SYKT后,活化的p53、p38、JNK表达减少,Bax转位减弱,线粒体膜电位趋于稳定,细胞色素C释放减少,凋亡相关蛋白caspase-3及PARP表达降低,心肌细胞凋亡明显得到抑制。通过与阳性对照PFT-α、SB203580、SP600125对比,SYKT效果确切,提示SYKT可通过抑制p53及MAPKs活化阻止细胞凋亡途径,起到心肌保护效应。[结论]本研究发现DOX通过活化p53及JNK-p38介导的细胞凋亡信号通路诱导了心肌细胞凋亡。SYKT可以有效的抑制这一过程。有望成为防治DOX诱导的严重心血管功能异常的安全有效的药物。
[Abstract]:Objective : To evaluate the effects of SYKT on bone marrow suppression and myocardial toxicity in mice . The results suggest that SYKT can alleviate the inhibition of bone marrow suppression and myocardial toxicity by inhibiting the proliferation of bone marrow cells and myocardial cells . [鏂规硶]绂讳綋鍩瑰吇灏忛紶鍘熶唬蹇冭倢缁嗚優,閫氳繃鑲岄挋铔嬬櫧鈪，

本文编号：1493397