β-榄香烯对放射和乏氧诱导的肺癌细胞募集巨噬细胞的作用及其机制的研究

发布时间：2018-02-11 03:02

本文关键词： β-榄香烯放射治疗乏氧巨噬细胞肺癌细胞　出处：《大连医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞,是肿瘤微环境中非常重要的细胞成分。研究发现,放射和乏氧情况下肿瘤细胞对巨噬细胞的募集增多,即局部浸润的TAM增多,且这些TAM多呈现出促肿瘤的表型,促进肿瘤细胞生存,血管生成,抑制肿瘤局部的免疫反应,这在一定程度上增加了肿瘤对放疗的抵抗。因此研究放射和乏氧情况下巨噬细胞浸润增多的原因,采用相应的治疗方法抑制巨噬细胞浸润,则可以增加肿瘤对放疗的敏感性,改善治疗效果。β-榄香烯(β-elemene)是从中药温郁金提取的化合物,具有放疗增敏作用,目前研究发现其主要通过促进细胞凋亡、增强DNA损伤和抑制DNA修复等方面增强肿瘤细胞的放疗敏感性。但其是否对肿瘤中巨噬细胞浸润的过程有影响,还未见研究报道。放射可以激发活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,调节过氧化物酶-1(Peroxiredoxin-1,Prx-1)等过氧化物酶的表达及核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等信号通路的活性,促进细胞存活。肿瘤乏氧是实体瘤中常见的现象,而放射会破坏肿瘤的血管结构,进一步加重肿瘤的乏氧。乏氧时低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达增高,调控下游多个基因的转录,使细胞适应乏氧微环境。Prx-1、NF-κB、HIF-1α等信号通路和因子是否在巨噬细胞浸润过程中发挥作用,尚不明确,有待进一步研究。因此,本研究观察了放射和乏氧情况下,肺癌细胞对巨噬细胞浸润的影响及β-榄香烯对此过程的作用,并对肺癌细胞募集巨噬细胞的机制进行了探讨。旨在揭示放射和乏氧时巨噬细胞浸润增多的原因,以便采取针对性的治疗措施来抑制此过程,增加肿瘤的放疗敏感性;同时也进一步明确了β-榄香烯的放疗增敏机制,为其在临床上的合理应用提供依据。目的:1.研究放射和乏氧情况下,β-榄香烯对肺癌细胞募集巨噬细胞的影响。2.研究放射和乏氧情况下,肺癌细胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表达及在肺癌细胞募集巨噬细胞过程中的作用,并进一步探讨这些因子之间的调控关系。3.研究放射及β-榄香烯对小鼠肺癌移植瘤生长及巨噬细胞浸润的影响,进一步验证体外实验结论。方法:第一部分:β-榄香烯对肺癌细胞募集巨噬细胞的影响1.MTT法检测不同浓度β-榄香烯对小鼠Lewis肺癌细胞的生长抑制作用,计算24h的IC50,IC20和IC10。2.将Lewis细胞分为:(1)对照组:只接受DMEM培养基处理;(2)放射组:X线单次剂量4Gy照射;(3)药物组:β-榄香烯45μg/ml作用24h;(4)药物联合放射组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后予4Gy单次剂量照射;(5)乏氧组:乏氧培养24h;(6)放射联合乏氧组:X线单次剂量4Gy照射后,乏氧培养24h;(7)药物联合乏氧组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后,乏氧培养24h;(8)药物、放射联合乏氧组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后,X线单次剂量4Gy照射后,乏氧培养24h。收集各组细胞上清,即条件培养基(conditioned medium,CM),使用Transwell实验检测各组Lewis细胞对小鼠巨噬细胞RAW264.7的募集作用。3.实时定量PCR、ELISA实验检测Lewis细胞及上清中相关趋化因子m RNA和蛋白的表达。4.将趋化因子中和抗体加入对照组、放射组、乏氧组、放射联合乏氧组上清后,Transwell实验检测Lewis细胞对RAW264.7细胞募集的变化情况。5.使用各组上清培养RAW264.7细胞,Western Blot、实时定量PCR实验检测巨噬细胞分型标志物的表达。第二部分:肺癌细胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表达、相互调控及对巨噬细胞募集的影响1.Western Blot、实时定量PCR、免疫荧光实验检测放射和乏氧条件下,Lewis细胞中Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白及m RNA的表达。2.Lewis细胞分别转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA,在放射和乏氧条件下,收集上清,ELISA实验检测趋化因子的变化情况。3.提取细胞蛋白,Western Blot实验检测抑制一个基因表达后,其他两个基因蛋白表达的变化情况。4.Lewis细胞分为:(1)对照组(2)放射组(3)药物组(4)药物联合放射组(5)乏氧组(6)放射联合乏氧组(7)药物联合乏氧组(8)药物、放射联合乏氧组。提取细胞蛋白,Western Blot检测各组Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白表达。第三部分:放射及β-榄香烯对小鼠肺癌移植瘤生长及巨噬细胞浸润的影响1.采用细胞悬液皮下接种法建立小鼠(C57BL/6)肺癌移植瘤模型并随机分组(每组6只):对照组(Na Cl)、45mg/kgβ-榄香烯组、放射组(Na Cl+放射)、45mg/kgβ-榄香烯联合放射组。2.隔日测量移植瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线。3.末次处理后,观察14d,切取肿瘤,拍照,称瘤重,计算抑瘤率。4.移植瘤组织制作石蜡切片,免疫组化方法检测巨噬细胞浸润及趋化因子表达。结果:第一部分:1.β-榄香烯作用Lewis细胞24h的IC10、IC20、IC50分别为28.11μg/ml、43.75μg/ml和93.17μg/ml。2.与对照组相比,放射组、乏氧组和放射乏氧组的上清对RAW264.7细胞的趋化作用增强(P0.05),加入β-榄香烯后,各组这种增强的趋化作用被抑制(P0.05)。3.Lewis细胞中趋化因子MCP-1的m RNA表达在放射组、乏氧组和放射联合乏氧组增高(P0.05),且可以被β-榄香烯抑制(P0.05)。ELISA实验观察到放射组、乏氧组和放射联合乏氧组Lewis细胞MCP-1分泌增多(P0.05),加入β-榄香烯后,MCP-1分泌增多被抑制(P0.05)。4.将MCP-1中和抗体加入放射组、乏氧组和放射联合乏氧组的上清进行孵育后,与对应未加中和抗体组相比,上清对RAW264.7细胞的趋化作用减弱(P0.05)。5.使用各组上清培养RAW264.7细胞后,放射组、放射联合乏氧组的上清培养后的RAW264.7细胞,促肿瘤的M2表型标志因子ARG1蛋白表达及IL-10,MRC1m RNA表达增加(P0.05)。第二部分:1.放射和乏氧条件下,Lewis细胞Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α的表达:1)放射组、放射联合乏氧组Prx-1蛋白及m RNA表达增高(P0.05),乏氧组Prx-1蛋白及m RNA表达无变化(P0.05);2)放射组、乏氧组、放射联合乏氧组NF-κB/p65入核增多,HIF-1α蛋白及m RNA表达增高(P0.05)。提示放射调控了Prx-1表达、NF-κB/p65入核和HIF-1α表达;而乏氧不调控Prx-1表达,只调控NF-κB/p65入核和HIF-1α表达。2.Lewis细胞转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,各组上清MCP-1表达的变化:1)转染Prx-1 si RNA后,放射组、放射乏氧组MCP-1分泌不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P0.05),但乏氧组MCP-1分泌不受影响,仍增高(P0.05),提示抑制Prx-1表达影响放射诱导的MCP-1分泌,但不影响乏氧诱导的MCP-1分泌;2)转染NF-κB/p65 si RNA后,放射组、乏氧组和放射乏氧组MCP-1分泌均不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P0.05),说明抑制NF-κB/p65表达影响放射和乏氧诱导的MCP-1分泌;3)转染HIF-1α的si RNA后,放射组、乏氧组和放射乏氧组MCP-1分泌也不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P0.05),说明抑制HIF-1α表达影响放射和乏氧诱导的MCP-1分泌。3.Lewis细胞分别转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,其他两个基因蛋白表达的变化:1)转染Prx-1 si RNA后,放射组、放射联合乏氧组的HIF-1α表达增高及NF-κB/p65入核增多被抑制(P0.05),提示放射后Prx-1调控了NF-κB/p65入核及HIF-1α表达;2)转染NF-κB/p65 si RNA后,放射组、乏氧组、放射联合乏氧组HIF-1α表达增高被抑制(P0.05);放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达不受影响(P0.05),仍增高。提示放射和乏氧后NF-κB/p65调控了HIF-1α的表达,但不调控Prx-1表达;3)转染HIF-1αsi RNA后,放射组、乏氧组、放射联合乏氧组NF-κB/p65入核不受影响(P0.05),仍增加;放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达也不受影响(P0.05),仍增高。提示放射和乏氧后HIF-1α不调控NF-κB/p65入核和Prx-1表达。4.已有实验结果提示放射后Lewis细胞内存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α上下游调控关系,TLR4是介导NF-κB通路激活的重要因子,因此将Lewis细胞转染TLR4si RNA,抑制TLR4表达,放射诱导的NF-κB/p65入核增多被抑制(P0.05)。提示放射后Prx-1通过TLR4激活NF-κB。5.β-榄香烯抑制放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达增加、NF-κB/p65入核增加(P0.05);抑制放射组,乏氧组,放射联合乏氧组HIF-1α表达增加(P0.05);但对乏氧组的NF-κB/p65入核增加没有影响(P0.05)。第三部分:1.成功建立小鼠肺癌移植瘤模型,根据移植瘤体积获得各组的生长曲线,治疗第7天,各治疗组移植瘤体积均小于对照组(P0.05);至第15天,β-榄香烯联合放射组移植瘤体积明显小于其他各组(P0.05);增敏系数(enhanced factor,EF)为1.65,提示该剂量β-榄香烯具有放疗增敏作用。2.放射组、β-榄香烯组移植瘤重量小于对照组(P0.05),β-榄香烯联合放射组移植瘤重量小于放射组和β-榄香烯组(P0.05),放射组、β-榄香烯组、β-榄香烯联合放射组抑瘤率分别为:46.01%,36.81%和72.39%。3.与对照组相比,放射组巨噬细胞浸润增多(P0.05),β-榄香烯组联合放射巨噬细胞的浸润少于放射组(P0.05)。4.与对照组相比,放射组MCP-1表达增多(P0.05),β-榄香烯联合放射组MCP-1表达少于放射组(P0.05)。结论:第一部分:1.放射和乏氧促进肺癌细胞对巨噬细胞的募集,并且放射还可以促进巨噬细胞向促肿瘤M2表型转化。2.放射和乏氧促进肺癌细胞分泌MCP-1。3.放射和乏氧促进的肺癌细胞对巨噬细胞的募集依赖于MCP-1。4.β-榄香烯抑制放射和乏氧促进的肺癌细胞对巨噬细胞的募集。5.β-榄香烯抑制放射和乏氧促进的肺癌细胞分泌MCP-1。第二部分:1.放射可以诱导肺癌细胞Prx-1表达、激活NF-κB、促进HIF-1α表达;乏氧对肺癌细胞Prx-1的表达无影响,但可以激活NF-κB和促进HIF-1α表达。2.放射诱导的MCP-1表达依赖于Prx-1、NF-κB、HIF-1α;但乏氧诱导的MCP-1表达不依赖于Prx-1,只依赖于NF-κB、HIF-1α。3.放射后肺癌细胞存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α调节通路;乏氧后肺癌细胞存在NF-κB/HIF-1α调节通路。4.放射后Prx-1激活NF-κB依赖于TLR4。5.β-榄香烯抑制放射后肺癌细胞Prx-1表达、NF-κB激活及HIF-1α表达;β-榄香烯抑制乏氧后HIF-1α表达。第三部分:1.放射及β-榄香烯都可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,联合应用后抑制肿瘤效果更加明显,β-榄香烯具有放射增敏作用。2.放射后小鼠肺癌移植瘤内巨噬细胞浸润增多,β-榄香烯抑制其浸润增多。3.放射后小鼠肺癌移植瘤内MCP-1表达增多,β-榄香烯抑制其表达增多。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5

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