急性缺氧大鼠水代谢紊乱的机制研究

发布时间：2018-02-15 20:12

本文关键词： 缺氧水代谢平衡紊乱 TRPV4 Adropin Minocycline 血脑屏障　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的高原是我军重要战略方向。但是,高原环境特殊,严重影响部队的战斗力。如何从军事斗争的需要出发,做好急进高原部队的卫生保障,是我军高原医学研究的重要内容。平原人进入高原后,会出现急性高原病,包括高原肺水肿(High altitude pulmonary edema,HAPE)、高原脑水肿(High altitude cerebral edema,HACE)和急性高原反应(Acute mountain sickness,AMS)。HAPE和HACE是机体水代谢紊乱的结果;对于AMS,有人认为是轻度的高原脑水肿所致。不论是急性高原病患者还是进入高原后的相对健康人,普遍存在着饮水减少、体重降低等现象。因此,急进高原可引起机体以脱水或水肿为表现形式的水代谢紊乱。动物实验表明,急性低压缺氧可显著降低大鼠的饮水量。早在1981年就有人观察了大鼠在模拟海拔5400m急性缺氧时饮水量的变化,发现在缺氧的第1天,大鼠饮水量只有平原正常值的30%。尿量虽也显著减少,但减少的程度比饮水量的减少要轻,两者相比,尿量相对增加,机体脱水、体重降低,血球压积(Hematocrit,Hct)增加。进一步的研究证明,急性缺氧降低大鼠饮水量不能用渗透压感受器或容量感受器来解释。而我们在预实验中注意到,大鼠一旦进入缺氧环境,饮水行为立即减少,而脱离缺氧环境后饮水行为迅速恢复。我们推测,急性缺氧降低大鼠饮水量可能与中枢神经因素有关;饮水量下降的本质可能是缺氧对渴觉神经元的抑制或渴觉抑制性神经元的兴奋所致。参与大脑渴觉调节的神经核团很多。研究表明,前扣带回皮层(Anterior cingulate cortex,ACC)是渴觉调节的高级中枢,而室周器官(Circumventricular organs,CVOs)是渴觉信号的感知者和启动者。穹窿下器(Subfornical organ,SFO)位于CVOs的中央,周围富集大量血管及脉络膜,且缺乏血脑屏障,易受氧分压的影响。因此我们推测,SFO区的神经元有可能直接感知氧分压变化,进而影响动物的饮水行为。研究发现,SFO神经元上的辣椒素受体(transient receptor potential-vanilloids,TRPVs)是渴觉兴奋产生的关键分子,主要包括TRPV1和TRPV4。有人通过中枢注射TRPV4激动剂,发现大鼠饮水量显著降低。也有实验证明,TRPV4对低氧分压十分敏感,是动物缺氧性肺血管收缩的重要因素。我们推测,缺氧有可能直接激活SFO区神经元上的TRPV4,导致大鼠饮水量减少。人和动物对高原缺氧环境的习服是在神经体液的整体调控下完成的。除了神经机制外,体液机制在缺氧大鼠饮水减少中可能也发挥着重要作用。文献表明,Adropin是由Enho基因编码的分泌型小分子蛋白,能够调节机体的物质代谢,且中枢注射Adropin能显著减少大鼠的饮水量。我们在预实验中也观察到缺氧大鼠血清中Adropin含量增高,因此,Adropin有可能是缺氧大鼠饮水量减少的体液机制之一。中度缺氧时,机体以习服代偿为主,但严重缺氧会引起血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的损伤和通透性增高。BBB由血管内皮细胞及其紧密连接、基膜及周围的星型胶质细胞足突、周细胞等结构组成,是极其稳定的中枢内环境稳态维持屏障。严重缺氧损伤BBB的原因包括内皮细胞凋亡和紧密连接蛋白降解,但相关分子机制仍未完全阐明。因此,探索BBB损伤的原因及分子机制,将有助于寻找HACE和AMS预防和治疗方法。综上所述,本课题拟在前期工作的基础上,从缺氧饮水减少和BBB损伤两个方向,研究急性缺氧大鼠水代谢紊乱的发生机制,这不仅有助于提高我们对高原习服机制的认识,也为我们做好急进高原部队的卫勤保障奠定坚实的理论基础。材料与方法1.本研究采用动物低压舱建立大鼠缺氧模型。分别在模拟3700m、4000m、6000m缺氧条件下研究大鼠饮水减少的发生及分子机制,在模拟8000m缺氧条件下研究血脑屏障损伤及修复方法。采用低氧细胞培养箱和三气缺氧小室,在体外构建细胞缺氧模型。2.采用大鼠颅内置管技术,缺氧前10min,脑室注射TRPV1抑制剂SB-705498,TRPV4抑制剂Gadolinium和HC-067047,缺氧相应时间后精确测量动物饮水量、颅内温度变化、渗透压变化。体外培养SFO区原代神经元和HEK293细胞,分别通过质粒和si RNA干预建立TRPV4过表达和敲降模型,利用Westernblot、Co-IP、IF、ELISA及Fura-3钙成像技术检测TRPV4蛋白表达及钙通道开放情况。3.采用大鼠颅内置管技术,在大鼠缺氧前7d,特异性的AVV-sh RNA靶向敲降CVOs区TRPV4表达,通过中枢注射重组Adropin蛋白、TRPV4抑制剂HC-067047,Cam KK抑制剂STO-609,外周注射高浓度Adropin抗体等方法,缺氧相应时间后测量动物饮水量、IF检测神经元活性、Westernblot检测TRPV4-Cam KK-AMPK信号通路变化;4.采用大鼠颅内置管技术,大鼠缺氧前48h,通过si RNA靶向敲降SIRT-3,缺氧前1h腹腔注射不同浓度的Minocycline,采用胶体金-电镜和伊文思蓝示踪法检测血脑屏障功能;在HBMECs细胞中,利用Westernblot、q RT-PCR、IF、萤光素酶报告基因法,检测HIF-1α/SIRT-3/PHD-2信号通路和紧密连接蛋白表达变化。结果1.与常氧组相比,大鼠4000m缺氧6h不会引起血液渗透压改变及颅内温度变化,但是饮水量下降75%;与缺氧组相比,第三脑室注射TRPV4抑制剂Gadolinium和HC-067047,能够显著增加饮水量,而TRPV1抑制剂SB-705498不会引起饮水量增加;此外,与野生型相比,常氧条件下TRPV4-/-小鼠饮水量没有明显变化,但是在缺氧条件下,TRPV4-/-小鼠饮水量显著增加。无论是过表达TRPV4的HEK293细胞,还是原代培养的SFO区神经元,缺氧或TRPV4激动剂4α-PDD都会使胞内钙离子迅速增加,产生钙离子脉冲,但是,在普通HEK293细胞或敲降TRPV4的SFO神经元中,缺氧几乎不能产生钙离子脉冲;在表达TRPV4的HEK293细胞和原代培养的SFO区神经元中敲降血红素氧合酶-2(heme oxygenase-2,HO-2)后,缺氧产生钙离子脉冲明显减弱,但此时TRPV4激动剂4α-PDD和抑制剂Gadolinium仍然能调控胞内钙离子变化;TRPV4和HO-2在SFO神经元中以二聚体的形式存在。2.与常氧组相比,大鼠3700m缺氧血清和CVOs区脑组织Adropin蛋白增加,同时CVOs区c-Fos阳性细胞数减少;与单纯缺氧组相比,注射Adropin中和抗体后饮水量升高35%,c-Fos阳性细胞数增加60%。常氧情况下,大鼠中枢注射重组Adropin蛋白后饮水量和CVOs区c-Fos阳性细胞数均显著减少;而与对照组相比,TRPV4敲降组注射重组Adropin蛋白后饮水量和c-Fos阳性细胞数显著增加。与对照组相比,中枢注射重组Adropin蛋白后CVOs区p-Cam KK、p-AMPKα蛋白显著增加,c-Fos阳性细胞数减少,大鼠饮水量下降;而注射TRPV4抑制剂HC-067047或Cam KK抑制剂STO-609均能降低CVOs区p-Cam KK、p-AMPKα蛋白的表达,增加c-Fos阳性细胞数,部分恢复大鼠饮水量。3.与常氧组相比,8000m缺氧伊文思蓝和胶体金血脑屏障通透性显著增高,HBMECs细胞跨细胞电阻TEER减小,HIF-1α、MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表达显著增加,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA降低,HIF-1α对VEGF转录活性显著增高。与溶剂对照组相比,Minocycline剂量依赖性的降低伊文思蓝和胶体金通透性,增加内皮细胞TEER,下调MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表达,但Minocycline仅能上调HIF-1α蛋白而非m RNA表达,Minocycline能同时上调ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA表达。然而,HIF-1α抑制剂YC-1或稳定剂DMOG均能调控Minocycline引起的上述变化。与常氧组相比,缺氧诱导HIF-1α上调的同时显著下调SIRT-3和PHD-2蛋白表达,与缺氧组相比,Minocycline抑制HIF-1α同时上调SIRT-3和PHD-2蛋白表达,SIRT-3敲降后Minocycline对HIF-1α的抑制作用减弱,SIRT-3和PHD-2显著上调。结论1.急性缺氧可引起大鼠饮水量减少,严重的急性缺氧可损伤大鼠血脑屏障。2.急性缺氧大鼠饮水减少与中脑SFO区神经元TRPV4开放密切相关。TRPV4与HO-2在SFO区神经元细胞膜上以复合体的形式存在。缺氧时,大鼠饮水减少有可能是通过HO-2感知氧分压变化、开放效应分子TRPV4引起中枢SFO区神经元胞浆[Ca2+]i升高,进而抑制口渴中枢所致。3.急性缺氧引起小分子蛋白Adropin表达增高参与大鼠饮水减少的机制。Adropin通过作用于中枢CVOs区TRPV4钙离子通道,引起其下游钙离子相关的Camkk-AMPK信号通路磷酸化,活化TRPV4渴觉抑制性神经元,减少大鼠饮水量。4.严重缺氧损伤血脑屏障,Minocycline通过激活SIRT-3/PHD-2信号通路,促进HIF-1α降解,使HIF-1α介导的VEGF、MMP-2、MMP-9表达减少,而内皮细胞间的紧密连接蛋白表达上调,保护血脑屏障。实验结果提示:在进入高原后的早期,饮水减少是中枢神经主动抑制的结果。对于急进特高海拔或严重缺氧的人来讲,Minocycline可望成为防治高原脑水肿的潜在药物。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R82

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