益气化瘀解毒方抑制结肠癌转移及其机制研究

发布时间：2018-02-16 15:15

  本文关键词： 益气化瘀解毒方 结肠癌 肿瘤干细胞 固有免疫　出处：《南京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:肠癌转移是恶性肿瘤的生物学特征,是医学研究的重大课题,从现有的国际国内的研究进展来看,肿瘤的转移可能一方面与肿瘤干细胞相关,另一方面与机体的免疫力相关。本实验的目的是观察中医药"益气化瘀解毒"方对结肠癌转移的影响,并从结肠癌干细胞及荷瘤鼠的固有免疫这两个方面进一步探讨其可能的机制。研究方法:1、选取复方中的中药单体,构建HPLC方法检测复方水煎剂中对应物质的含量,为中药的质控奠定基础。2、检测多株结肠癌细胞株的细胞表面CD133和CD44分子,明确其表达情况。3、体外分选CD133和CD44同时高表达的细胞和CD133和CD44同时低表达的细胞,比较其干性和分化标志物的核酸水平、细胞周期的异同、无血清培养条件下的克隆球形成的能力、恢复血清后的细胞分化能力、软琼脂克隆形成能力;进而进行体内实验,将分选得到的CD133和CD44同时高表达的细胞和CD133和CD44同时低表达的细胞分别接种于裸鼠腋下,3周后比较其成瘤能力,同时再次检测瘤组织内细胞表面的CD44和CD133的表达情况。4、使用培养基中直接加药的方法考查体外"益气化瘀解毒"方对结肠癌干细胞的影响。使用裸鼠脾脏接种结肠癌细胞,灌胃"益气化瘀解毒"方3周后,流式检测脾脏中结肠癌肿瘤干细胞的比例。5、"益气化瘀解毒"方对裸鼠皮下移植瘤的影响,比较中药干预3周后的移植瘤的大小和其他一般情况。6、通过在裸鼠结肠原位接种相同体积的荧光标记的结肠癌组织块,比较阴性对照组、"益气化瘀解毒"方组、5-Fu组及中西医结合组的结肠癌种植转移的情况。7、通过在裸鼠脾脏注射相同数目的荧光标记的结肠癌细胞,比较阴性对照组、"益气化瘀解毒"方组、5-Fu组及中西医结合组的结肠癌肝转移的情况。8、通过流式细胞术分析"益气化瘀解毒"方对裸鼠外周血和脾脏的固有免疫细胞(NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)的影响。9、通过细胞因子芯片的高通量筛选,比较"益气化瘀解毒"方干预3周后对造模裸鼠血浆细胞因子的影响。10、通过流式细胞术比较使用"益气化瘀解毒"方干预后对裸鼠的巨噬细胞的影响。研究结果:1、建立了 HPLC方法,在中药复方中成功检测出了尿囊素、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、甘草酸,为中药复方的质控奠定了基础。2、在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29、SW480、SW620、LoVo、HCT-116中,只有HCT-116这株细胞是具有较高比例的CD133和CD44同时高表达的细胞亚群。3、体外实验使用流式分选得到CD133和CD44同时高表达的细胞以及CD133和CD44同时低表达的细胞,发现前者中干性标志(CD133、ALDH2和Lgr5)也高表达,而分化指标CK20为低表达(p0.05);细胞周期检测显示CD133和CD44同时高表达的细胞更多地处于GO/G1期,无血清培养和软琼脂培养显示其有更强的克隆球形成能力,恢复血清后,其克隆球又能恢复多形性的贴壁细胞。体内实验为注射分选得到的不同的亚群细胞进行皮下成瘤实验,结果显示,CD133和CD44同时高表达的细胞的皮下成瘤能力更强,注射105和104个细胞时,100%成瘤,注射103个细胞仍有4/9只成瘤,比CD133和CD44同时低表达的细胞组高出一倍,同时瘤重也较重;另外在瘤组织重新研磨后检测CD133和CD44同时高表达的细胞亚群比例上,注射105组为6.8%±1.8%(v.s.2.6%±0.8%,p0.05),说明了 CD133和CD44共同高表达的细胞是HCT-116细胞株中的肿瘤干细胞。4、体外实验考查了益气化瘀解毒方对结肠癌干细胞的影响,在培养基中直接加入中药复方干预,CD133和CD44同时高表达的细胞亚群比例变化不大,体内实验造模脾脏注射结肠癌细胞肝转移的模型,对复方中药灌胃后的脾脏原位瘤的CD133和CD44同时高表达的细胞亚群比例改变影响有限(14.97%± 8.08%v.s.13.75%± 6.93%,p=0.790)。5、在皮下移植瘤模型中,益气化瘀解毒方干预3周后,与阴性对照组、5-Fu对照组及中药小剂量联合5-Fu组相比,中药的大、小剂量组的裸鼠体重没有明显变化(p0.05),皮下移植瘤的重量虽有下降,但没有统计学差异(p0.05)。6、使用在裸鼠结肠组织原位移植荧光标记的结肠癌组织的方法,观察益气化瘀解毒方干预3周后的效果,其种植转移率分别为:阴性对照组33.3%,5-Fu对照组28.6%,中药组0%,中药联用5-Fu组0%,但由于例数较少,故经卡方检验,p0.05。7、构建脾脏注射荧光标记的HCT-116结肠癌细胞肝转移的模型,益气化瘀解毒方干预后,其体重各组间无明显差异,存活率5-Fu组最低(66.7%),肝转移率为:阴性对照组90.9%(10/11只),5-Fu对照组71.4%(5/7只),中药组44.4%(4/9只),中药联用5-Fu组30.0%(3/10只),与阴性组相比,中药组和中药联合5-Fu组均具有统计学差异(p0.05)。8、在上述结肠癌肝转移模型的基础上,使用流式细胞术检测益气化瘀解毒方干预后的裸鼠外周血与脾脏中的NK细胞活化率、巨噬细胞含量和中性粒细胞含量,发现在外周血的中性粒细胞占粒细胞设门位置里CD45+细胞的含量方面,益气化瘀解毒方组明显高于阴性对照组(77.09%± 12.55%v.s.61.76%± 11.51%),差异具有统计学意义(p0.05)。9、细胞因子芯片检测益气化瘀解毒方干预后的裸鼠外周血血浆,发现GM-CSF、γ-IFN、IL-1a、IL-3、IL-6、IL-13、IL-17水平高于阴性对照组2倍以上。10、使用无荷瘤裸鼠直接中药干预模型,发现益气化瘀解毒方干预2周后,与阴性组相比,脾脏的巨噬细胞比例明显增加,2.09%±0.42%v.s.1.28%±0.26%,p0.05。同时发现拆方的扶正治疗组和祛邪治疗组与阴性组相比,均不能达到有统计学意义的差异。研究结论:益气化瘀解毒方能通过激活机体的固有免疫系统,尤其是通过增加中性粒细胞和巨噬细胞的含量,迅速杀灭游走于血液系统中的脱离原发灶的结肠癌细胞,达到减少结肠癌种植转移和结肠癌肝转移的目的,体现了中医理论中"益气"的指导思想。结肠癌细胞中的CD133和CD44同时高表达细胞是其肿瘤干细胞的标志,而益气化瘀解毒方对其影响有限,提示中药复方可能不是通过这个途径达到抗肿瘤转移的目的。拆方的研究显示了该复方的构成具有特殊性,"扶正"和"祛邪"缺一不可,体现了中药复方的独特效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：1515813