P311在表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-23 23:21

  本文关键词： P311 表皮干细胞 肌成纤维样细胞 肌成纤维细胞 转分化 上皮间质转化 转化生长因子β1　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:烧伤、创伤、手术、糖尿病等引起的皮肤创面是常见的临床问题之一。如何有效促进创面愈合、避免瘢痕形成是治疗皮肤创面的关键。但由于对创面愈合和瘢痕形成的机制不甚清楚,导致创面和瘢痕的治疗效果十分有限。目前认为,肌成纤维细胞在创面愈合和瘢痕形成中发挥关键作用:肌成纤维细胞产生的强大收缩力可以促进创面的快速闭合,但是如果肌成纤维细胞活性持续升高,则会导致瘢痕形成。皮肤创面愈合过程中,局部的成纤维细胞、骨髓和外周血中的纤维细胞、血管周细胞、血管平滑肌细胞等是经典的肌成纤维细胞主要来源。表皮细胞主要通过分泌TGFβ1、b FGF、IL 1β、TNFα等因子来调控成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。我们推测,表皮干细胞(Epidermal stem cells,Ep SCs)可能具有转分化为肌成纤维细胞或肌成纤维样细胞(Myofibroblast-like cells,MFLCs)的潜能,主要依据包括:(1)创面再上皮化过程中存在着上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的行为特点。创面再上皮化时,创缘的Ep SCs逐渐失去紧密连接和顶底极性,溶解基底膜,发生细胞骨架重排,获得间质细胞的特性,从而具备较强的迁移能力。(2)角质形成细胞具有转分化为肌成纤维细胞的潜能,而Ep SCs可以分化为角质形成细胞,并且是创面再上皮化的主要功能细胞。在TGFβ1、TNFα、IL 1β和FBS刺激下,表皮中的角质形成细胞可以直接转分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞。人角质形成细胞具有向脂肪细胞、平滑肌细胞和神经细胞分化的潜能,甚至在连续传代过程中就可有能发生EMT。(3)研究表明,创缘的表皮细胞可能是早期创面收缩力的主要来源,其收缩作用甚至早于创缘和肉芽组织中的肌成纤维细胞。(4)创面局部缺氧环境和大量的细胞因子(如TGFβ1、IL1β、TNFα)也可以诱导EMT。P311,又称为神经元再生相关蛋白(Neuronal regeneration related protein,NREP)、戊四唑17(Pentylenetetrazol 17,PTZ17)、神经元蛋白3.1(Neuronal protein 3.1)等,是一种约8k Da的功能未知的胞浆蛋白,因为含有三个PEST结构域和多个赖氨酸残基,极易被泛素蛋白酶和基质金属蛋白酶降解,P311蛋白在细胞内的半衰期仅约5分钟。目前研究表明,P311参与了神经再生、肺泡发育、肿瘤细胞侵袭、血压稳态维持、创面愈合和瘢痕形成。本课题组和他人结果表明,P311高表达于皮肤创面新生表皮的Ep SCs、肉芽组织的肌成纤维细胞和增生性瘢痕中,并且P311敲除小鼠的皮肤缺损创面愈合速度减慢。P311还可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和Ep SCs迁移。因此,P311在肌成纤维细胞生成和Ep SCs调控中发挥重要作用。研究发现,P311是TGFβ1/Smad信号通路的重要调控因子:P311可以通过调控TGFβ1的自我诱导、TGFβ1的翻译等调控TGFβ1表达,进而调控下游Smad信号通路。而TGFβ1/Smad信号通路是创面愈合和EMT的关键调控机制之一。因此,我们提出如下科学假说:P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控创面愈合过程中表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化(Epidermal stem cell to myofibroblast-like cell transdifferentiation,Ep My T)。本研究主要分为以下三个方面:P311在Ep My T中的具体作用,P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控Ep My T,P311调控TGFβ1的可能分子机制。方法:1.P311在表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。1.1 P311在体外小鼠和人原代表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。利用两步消化法、IV型胶原差速贴壁法和KSFM无血清培养基,从人包皮和新生小鼠中分离培养原代Ep SCs,并利用流式细胞术进行鉴定。利用腺病毒转染技术使Ep SCs高表达P311,利用流式细胞术和实时定量PCR检测转染效率。利用免疫荧光染色、实时定量PCR和Western blot检测P311高表达后Ep SCs中表皮干细胞标志E-cadherin和β1 integrin、肌成纤维细胞标志Vimentin和α-SMA的表达水平,利用Western blot检测I型胶原和MMP2表达,利用凝胶收缩实验观察Ep SCs收缩能力,利用划痕实验观察Ep SCs迁移能力。1.2 P311在体内小鼠和人烧伤创面Ep My T中的作用。利用恒温烫伤仪制作小鼠背部浅II°烫伤模型,大体和HE染色观察P311敲除小鼠和野生型小鼠的伤口愈合和再上皮化规律,免疫组化染色观察表皮中Vimentin和α-SMA的表达情况,实时定量PCR和Western blot检测创面Ep My T相关标志物的表达水平。利用免疫组化染色和连续切片、免疫荧光染色复合免疫组化染色等技术观察烧伤患者表皮中P311、Vimentin和α-SMA的表达以及共定位情况。1.3烧伤创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA表达的影响。利用实时定量PCR检测IL1β、TNFα、IL6和缺氧等创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA m RNA表达的影响。2.P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控Ep My T。2.1 P311对TGFβ1/Smad通路的调控作用。利用ELISA、实时定量PCR和Western blot检测高表达或敲除P311对TGFβ1m RNA、TGFβ1蛋白合成和分泌的影响。利用Western blot检测高表达或敲除P311对Smad 2和Smad 3蛋白表达和磷酸化的影响。2.2 TβRI/II抑制剂LY2109761、Smad3 si RNA和外源性TGFβ1对P311引起的Ep My T的调控作用。利用免疫荧光染色和Western blot检测TβRI/II抑制剂LY2109761对P311引起的Ep My T的阻断作用。利用Western blot检测Smad3 si RNA对P311引起的Ep My T的阻断作用。利用Western blot检测外源性TGFβ1对P311敲除小鼠Ep SCs转分化能力的恢复作用。3.P311调控TGFβ1表达的分子机制。3.1 P311调控TGFβ1表达的主要阶段。利用TGFβ1启动子报告基因载体、亚硫酸氢盐测序法、放线菌素D刺激复合实时定量PCR法、TGFβ1非翻译区(Untranslated region,UTR)报告基因载体等检测P311对TGFβ1启动子活性、启动子甲基化、m RNA稳定性和UTR活性的影响。3.2 P311调控TGFβ1 UTR活性的可能机制。Genebank下载所有物种P311和TGFβ1氨基酸和m RNA序列,利用DNAMAN软件进行P311和TGFβ1多序列比对、同源性分析和进化树绘制,利用DNASTAR分析TGFβ1各区段长度和GC含量,利用RPISeq和Lnc Pro预测人P311蛋白和人TGFβ15’-UTR和3’-UTR各调控区域的相互作用可能性,利用BINDN+、RNABINDRPLUS和SNBRFinder预测P311蛋白的可能RNA结合位点。3.3 P311可能通过e IF6间接调控TGFβ1的蛋白表达。利用Western blot检测Ep SCs中高表达或敲除P311对e IF6表达的影响、敲降或沉默e IF6对TGFβ1蛋白表达的影响。结果:1.P311在体外小鼠和人原代表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。1.1成功分离培养并转染小鼠和人原代Ep SCs。培养的Ep SCs呈克隆样生长,每个细胞呈立方形,并且95%以上的细胞为CD49f+CD71—Ep SCs。腺病毒转染48小时后,95%以上Ep SCs表达GFP,P311 m RNA含量明显升高。1.2 P311促进小鼠表皮干细胞向肌成纤维样细胞,而不是肌成纤维细胞转分化。P311腺病毒转染72小时后,小鼠Ep SCs体积变大、呈长梭形和扁平状,α-SMA和Vimentin阳性细胞比例升高、E-cadherin阳性细胞比例下降,细胞骨架由网状皮质排列重排为应力丝结构,α-SMA蛋白和m RNA水平分别升高为空载体组的2.69倍(P0.05)和1.56倍(P0.01),Vimentin蛋白水平升高为空载体组的1.72倍(P0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分别降低为空载体组的32%和68%(P0.05)。P311组Ep SCs迁移指数升高到空载体组的6.29倍(P0.01),I型胶原和MMP2蛋白水平分别升高到空载体组的11.21倍和1.45倍(P0.05),但P311组和空载体组胶原凝胶均未出现明显收缩。1.3 P311促进人表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化。P311高表达后,人Ep SCs内α-SMA+细胞比例显著升高(35%vs 3%,P0.01),E-cadherin阳性细胞比例显著降低(22%vs 63%,P0.01)。同时,α-SMA蛋白水平升高为空载体组的2.09倍(P0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分别降低为空载体组的57.68%和32.87%(P0.05)。2.P311在人和小鼠烧伤创面Ep My T中的可能作用。2.1 P311敲除小鼠烧伤创面愈合和再上皮化速度减慢。大体观察发现,P311敲除小鼠伤口绝对面积和面积百分比在伤后2天、4~7天均显著高于P311野生型小鼠。HE染色发现,伤后4天和7天P311敲除小鼠伤口再上皮化速度显著慢于P311野生型小鼠。伤后7天,P311敲除小鼠伤口的表皮间距显著宽于P311野生型小鼠(9.87 mm vs 6.82 mm,P0.05),新生表皮长度显著短于野生型小鼠(1.48 mm vs 2.14 mm,P0.05)。2.2 P311敲除小鼠烧伤创面中Ep My T水平可能下降。免疫组化染色发现,P311敲除小鼠新生表皮中Vimentin+细胞数目低于P311野生型小鼠,而未观察到表皮α-SMA的特异性表达。P311敲除小鼠创面内Vimentin、TGFβ1、TWIST1和Snail2 m RNA水平均显著低于P311野生型小鼠。并且,P311敲除小鼠创面内β1 integrin蛋白水平显著高于P311野生型小鼠。P311敲除小鼠正常皮肤和烧伤创面中Vimentin、LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白水平显著低于P311野生型小鼠。2.3 P311在人烧伤创面Ep My T中的可能作用。烧伤创面表皮中α-SMA、Vimentin、P311阳性细胞均多于正常皮肤,共染发现人烧伤创面表皮中存在着P311+α-SMA+细胞和P311+Vimentin+细胞。3.烧伤创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA m RNA表达的影响。IL1β和TNFα使Ep SCs内P311 m RNA水平升高40倍以上(P0.01),缺氧使其升高7.58倍(P0.01),IL6使其升高4.05倍(P0.05)。并且,IL1β、TNFα、IL6和缺氧均引起Ep SCs内α-SMA m RNA水平明显升高(P0.05)。4.P311对TGFβ1/Smad通路的调控作用。4.1 P311对TGFβ1表达的调控作用。P311组Ep SCs内LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白的水平分别升高到空载体组的4.21和6.89倍(P0.01),TGFβ1 m RNA水平下降至空载体组的78.81%(P0.01),TβRI和TβRII m RNA水平分别升高到空载体组的1.72倍(P0.05)和2.22倍(P0.01)。P311敲除小鼠Ep SCs的培养上清内TGFβ1总蛋白水平降至P311野生型小鼠Ep SCs的51.15%(P0.05)。4.2 P311促进Smad2和Smad3蛋白的磷酸化。P311组Ep SCs内p Smad2和p Smad3比例分别升高为空载体组的2.51倍和2.80倍(P0.01)。外源性TGFβ1刺激下,P311敲除小鼠Ep SCs内p Smad2和p Smad3比例分别降至P311野生型小鼠Ep SCs的52.17%和65.71%(P0.05)。但敲除或高表达P311对Smad2和Smad3总蛋白水平无显著影响。5.TβRI/II抑制剂LY2109761阻断P311引起的Ep My T。LY2109761可以显著抑制P311引起的p Smad2和p Smad3表达升高。LY2109761可以使P311高表达Ep SCs失去肌成纤维细胞样形态。并且,LY2109761将P311组α-SMA+细胞比例从39.99%降至7.93%,将E-cadherin+细胞比例从8.37%升至43.43%(P0.01)。同时,LY2109761可显著抑制P311组Ep SCs内升高的α-SMA和Vimentin蛋白水平,提高P311组Ep SCs内降低的β1integrin和E-cadherin蛋白水平(P0.01)。此外,LY2109761可显著降低P311组Ep SCs内I型胶原和MMP2蛋白水平。6.Smad3 si RNA阻断P311引起的Ep My T。Smad3 si RNA可使Smad3蛋白水平降低为P311组的40.64%(P0.05),几乎完全抑制p Smad3的表达(P0.01)。P311+Smad3 si RNA组Ep SCs内α-SMA水平显著低于P311组和P311+mock si RNA组(P0.01),E-cadherin水平显著高于P311组和P311+mock si RNA组(P0.01),但与空载体组无显著差异。7.外源性TGFβ1可以恢复P311敲除小鼠Ep My T的能力。TGFβ1刺激后,P311敲除小鼠和野生型小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平均显著升高。并且,TGFβ1刺激后的P311敲除小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平与TGFβ1未刺激的P311野生型小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平无显著差异。8.P311通过促进启动子甲基化和提高UTR活性调控TGFβ1表达。P311对TGFβ1启动子活性无显著影响,但可以增加TGFβ1启动子的甲基化位点。m RNA稳定性结果发现,P311组TGFβ1 m RNA的降解速率略低于空载体组(斜率:-0.0805 vs-0.112),但二者无统计学差异(P=0.4531)。并且,P311组TGFβ1 5’-UTR、3’-UTR’和3’/5’-UTR的活性均显著高于空载体组。9.P311调控TGFβ1 UTR活性的可能机制。14个物种间TGFβ1的氨基酸和ORF区域相似率均在80%以上,而5’-UTR和3’-UTR区域的总相似率分别仅为30.45%和15.18%。人和小鼠TGFβ1 5’-UTR的长度分别为889bp和867bp,GC含量分别为71.6%和65.9%;3’-UTR长度分别为521 bp和134bp,GC含量分别为57.8%和76.9%。P311结合于TGFβ1 5’-UTR中63~121和422~615的抑制区域、77~106的茎环区域和3’-UTR的可能性大于50%。进一步分析发现,29R、31P、33P、34K、35E、36V、37N、38R、39K可能是P311结合于RNA的主要位点。10.P311可能通过e IF6间接调控TGFβ1蛋白表达。P311高表达引起Ep SCs内e IF6蛋白表达下降,而P311敲除引起e IF6蛋白表达升高。e IF6敲降或沉默使Ep SCs内活性TGFβ1和LAP-TGFβ1的水平明显升高。结论:本研究首次证实,P311是一种新的表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化的调控因子,并且TGFβ1/Smad通路在其中发挥重要的调控作用。P311通过增强TGFβ1启动子甲基化抑制TGFβ1转录,通过结合并激活TGFβ1 5’-UTR和3’-UTR促进TGFβ1翻译。烧伤创面局部的炎性因子和缺氧微环境可诱导表皮干细胞P311的表达。敲除P311可导致烧伤创面愈合延迟。因此,研究结果不仅可以表明表皮干细胞可能是皮肤创面愈合中肌成纤维细胞的另一重要来源,更为重要的是,发现了一种新的皮肤创面愈合机制,即:炎性因子和缺氧-P311-TGFβ1-Smad2/3-Ep My T-MMP2和I型胶原分泌增多-迁移能力增强-创面愈合加快。研究结果丰富和完善了P311的生物学功能和烧伤创面愈合机理,同时为创面愈合的基础研究和临床治疗提供新靶点和新线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R64
，

本文编号：1528000