CAI对DSS诱导的小鼠结肠炎之治疗作用及其机理研究

发布时间：2018-02-26 11:08

本文关键词： CAI 结肠炎 DSS THP-1 NF-κB NLRP3 炎症体　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景与目的自身免疫性疾病炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和克罗恩病(Crohn's disease)的统称,其病因及发病机制至今尚未完全明确[1]。近几年来基础以及临床研究表明,炎性细胞因子如TNF-α等的升高与自身免疫性疾病炎症性肠病密切相关,已有大量的实验室和临床资料证明,TNF-α抑制剂对上述疾病都可能有一定的疗效。这就使得TNF-α抑制剂成为新药研究和发展的新热点。到目前为止,已经得到批准的TNF-α抑制剂(TNF-α单抗和可溶性TNF-α受体)都是生物制品。虽然它们的疗效已经得到证实。但也存在不少缺陷。例如,作为蛋白制剂需注射给药,而且长期使用会产生抗体及相关的问题,其价格也尤为昂贵。因此探索治疗自身免疫疾病的抗炎性细胞因子药物的研发,寻找可以口服的、低制造成本的小分子化学合成药物,已经成为全球新药研发方向羧胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)是一种正处于临床前实验中的非细胞毒性抗肿瘤药物,其可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管生成。近年来,我们课题组发现羧胺三唑对一些急、慢性炎症模型表现出了较强的抗炎效果。尤其是对动物模型中的一些抗炎因子有较强的抑制作用,包括IL-1β、TNF-α、IL-6等在IBD中起着重要作用的炎症因子,那么CAI是否对IBD也有作用?其作用机理是否与细胞因子的过度表达以及NF-κB信号通路和NLRP3炎症体的活化关系密切?因此我们建立了相关的动物和细胞模型,来进一步探讨其药理作用及和可能的作用机制。研究方法体内实验主要是采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导急性小鼠结肠炎模型,对小鼠的体重、粪便形状、便血程度等进行DAI(疾病活动指数)评分、结肠组织的病理病变情况进行大体评分、对结肠组织的病理切片进行组织学评分、检测血清和组织中与炎症相关及肠道病变的一系列标志物(MPO、Lipocalin-2和FITC荧光强度)来评价药物的治疗效果。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测造模和给药7天后动物结肠组织中相关细胞因子的表达和分泌水平,包括IL-lβ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β的水平。采用Western blot和免疫组织化学染色法检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平,包括NF-κBp65、IκBα和磷酸化IκBα。采用q-PCR法检测NLRP3炎症体(包括NLRP3、ASC和caspase-1)的mRNA水平,采用采用Western blot和免疫组织化学染色法检测NLRP3炎症体相关的各蛋白在结肠组织中的表达水平,包括 NLRP3、ASC、pro-caspase-1 和 caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的前体与成熟体蛋白。体外实验我们选用了研究炎症常用的THP-1急性粒细胞白血病细胞株,PMA对其进行诱导使其成为巨噬细胞后,使用脂多糖(LPS)对其进行刺激使其产生炎症反应。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LPS刺激后细胞上清中TNF-α、IL-lβ和IL-18等炎症因子的水平,评价模型是否建立成功以及羟胺三唑是否在细胞水平上抑制炎症因子的产生。采用Western blot法检测NF-κB信号通路和NLRP3炎症体相关蛋白的表达水平,包括IκBα和磷酸化IκBα,NLRP3、ASC、pro-caspase-1和caspase-1。通过上述在细胞水平的检测来印证动物实验关于药物作用途径的猜想和假设。研究结果1.2%DSS持续给药7天可成功诱导小鼠急性结肠炎模型。其病理表现主要为大肠缩短,肠壁变薄,肠道通透性变高,黏膜显著充血水肿,散在性糜烂或溃疡伴出血,黏膜炎症细胞浸润,隐窝脓肿及杯状细胞消失或减少等。2.CAI对由结肠炎引起的动物的体重减轻情况有显著改善,并可以降低DAI评分。3.CAI中、高剂量组对动物结肠组织的病理改变明显减轻。4.CAI对结肠炎的组织和血清中相关炎症标记物MPO活性有明显降低作用,还可使肠道通透性下降,Lipocalin-2水平下降,表明其对于炎症有缓解作用。5.病理切片H.E染色结果显示,给予中、高剂量CAI后,小鼠结肠黏膜损伤累及的范围减小,杯状细胞缺失程度和隐窝结构破坏程度减轻,中性粒细胞浸润减少。6.使用酶联免疫吸附法检测动物组织中炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β)的水平,给予CAI后均有不同程度的降低,特别是CAI高剂量组与造模组相比均有显著性差异。7.Western blot法检测发现,给予造模剂后IL-1β和IL-18蛋白的前体和成熟体的表达显著升高,而给予CAI后,对四种蛋白的表达均有抑制作用。8.免疫组织化学染色的结果显示,CAI可以显著降低NF-κB p65在细胞核中的表达,同时胞浆中的染色程度也比较浅。而造模组的NF-κB p65在细胞核中的表达与Normal组相比显著升高。9.Western blot法检测发现,CAI可以明显抑制造模剂引起的动物结肠组织中IκBα的降解以及磷酸化`κBα含量的升高。10.q-PCR的结果显示,NLRP3和caspase-1的mRNA水平在给予CAI之后相比造模组显著降低,而ASC的mRNA水平在各组间无明显差异。11.Western blot和免疫组织化学染色方法检测的结果均显示,小鼠结肠组织中NLRP3和caspase-1的蛋白表达水平在给予CAI之后,有显著的下调。而ASC的表达在各组间无明显差异。12.使用CCK-8法和SRB法检测细胞增殖发现,羧胺三唑对于THP-1细胞没有明显的抑制增殖的毒性作用。13.羧胺三唑对于LPS刺激的分化的THP-1细胞中高表达的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18具有显著的降低其分泌的作用。14.使用Western blot方法检测LPS刺激的分化的THP-1细胞中p-IκBα和IκBα的蛋白表达水平,发现CAI可以抑制IκBα的磷酸化,高剂量的CAI还可以抑制IκBα的降解。15.使用Western blot方法检测LPS刺激的分化的THP-1细胞中NLRP3相关蛋白的表达,发现CAI可以抑制NLRP3蛋白的表达和caspase-1的活化,而ASC在各组之间无明显差异。结论CAI能够明显改善实验动物的体重、食物消耗量、临床评分、宏观评分和组织学评分等情况。同时明显减轻动物结肠充血、肠壁变薄的情况,减小黏膜缺损区;组织学观察可见黏膜损害累及的结肠范围缩小,毛细血管扩张、淋巴滤泡增生、黏膜下层水肿和隐窝结构破坏程度明显减轻。CAI能显著降低结肠炎小鼠结肠匀浆中MPO的活性;显著降低结肠炎小鼠血清中Linpocalin-2的含量;对维持肠道完整性有明显的保护作用。对结肠匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等细胞因子水平具有明显抑制作用,且明显下调结肠组织中NF-κB p65核转位水平。其可能是通过NF-κB和NLRP3炎症体通路发挥作用。表明CAI对小鼠实验性结肠炎具有良好的治疗作用,其药效发挥的作用机制可能与其抑制NF-κB和NLRP3炎症体的激活,进而降低炎症组织中升高的TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性细胞因子的水平有关。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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