HSP27对心脏衰老的延缓作用及机制研究

发布时间：2018-02-26 10:20

本文关键词： 线粒体自噬热休克蛋白27 氧化应激　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景由于当今社会正朝着老龄化社会不断演变,因此关注老龄化相关疾病的研究显得格外重要。心血管循环系统是维持人体正常生命活动的重要组成部分,然而心脏的再生能力十分有限,随着年龄的增长,心脏的收缩舒张功能逐渐衰退,这使得心脏逐渐难以维持其正常的泵血功能。因此,延长心脏衰老,维持心脏收缩舒张的泵血功能成为一个十分有意义的研究方向。研究表明,心脏衰老的发病机制涉及多个分子机制,包括氧化应激、自噬障碍,代谢变化,钙平衡调节障碍,和神经内分泌通路的激活等。心肌细胞终末分化的性质使得这些细胞内受损的大分子和细胞器特别容易积累,这就意味着需要增加自噬的激活来清理这些有害细胞的"垃圾",以维持细胞的稳态。不幸的是,心肌细胞自噬活性随着年龄的增长而下降,而细胞自噬的受损具有多重不良后果,包括降低心脏收缩功能和增加心律失常的风险等。随着年龄的增长,心脏中活性氧(reactive oxygen species ROS)的含量也随之增加,老化的心肌细胞内的ROS主要由受损的线粒体所产生的,与此同时ROS的异常蓄积亦会引起线粒体损伤,最终导致细胞的凋亡。由此可见线粒体是ROS生成的主要来源细胞器同时也是ROS攻击的靶细胞器。由于心肌细胞对线粒体能量代谢的高度依赖性,使得心脏在整个生命周期内都暴露在ROS的高负荷中。所以在一定程度下清除ROS,即抗氧化作用是延缓心脏衰老的有效措施。线粒体自噬是一个高度选择的自噬过程,可以促进清除功能障碍或不必要的线粒体。PINK1-Parkin通路是当下研究中较为受到关注的线粒体自噬途径。当线粒体膜电位消失,则导致PINK1稳定地在线粒体外膜存在,之后则会促进胞内E3泛素连接酶Parkin的招募和激活。激活的Parkin可以介导功能障碍的线粒体被自噬体吞噬以进而被选择性消除。因而通过激活PINK1和Parkin的线粒体自噬可以防止受损线粒体对心肌细胞进一步损伤,维持内环境稳态从而延缓心脏衰老。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一类生物体中组织结构高度保守的蛋白质,细胞可以由内源或者外源性应激源的刺激下诱导产生。热休克蛋白27(HSP27)是一种广泛表达于哺乳动物的小热休克蛋白亚家族的成员,在人类,其分子量为27kDa,在啮齿类动物中,其分子量为25kDa。HSP27除了在细胞分子水平上使错误结构的蛋白质完成正确的折叠和组装,通过信号转导,调节细胞的增殖,分化,凋亡外,还参与了组织在氧化应激、热休克反应、缺氧/缺血损伤等的调控。我们研究组和其他研究人员均发现高表达HSP27可以对抗缺血/再灌注损伤,心肌梗死,炎症反应,以及阿霉素诱导的心脏损伤,心功能障碍。HSP27对心脏保护的机制涉及抗氧化能力,抑制炎症反应,提高心肌细胞的存活率,以及自噬激活和提高线粒体活性等。因此,我们提出研究假设:高表达HSP27可以延缓由增龄引起的心脏衰老。目的在本项研究中,我们通过构建在心脏特异表达HSP27的转基因小鼠(Tg),同时选取年龄与之相匹配的野生型小鼠(WT)作为衰老模型的研究对象来探索HSP27对由年龄诱导的心脏衰老的作用及其可能涉及的机制。研究方法和内容1.实验动物的构建在南京大学动物模式所的协助下,构建心肌特异性表达的HSP27转基因小鼠(Tg),本研究以饲养2年(24个月)的Tg小鼠和性别,年龄与之相匹配的野生型小鼠(WT)作为衰老模型的研究对象。本实验的实验动物护理和实验报告均得到了南京大学动物保护委员会的批准。所有实验均遵守关于动物伦理使用的国际准则。2.小鼠心功能的检测通过Vevo770设备对小鼠进行超声心动图测量。在超声心动图测量时,2个月月龄的Tg小鼠和性别相匹配的WT小鼠作为青年对照组。通过M-mode型超声评价小鼠射血分数等心功能指标,或着通过脉冲多普勒评价二尖瓣功能。最终的实验数据为至少连续五个心动周期的平均值。3.马松三色染色将心脏组织收集后,用4%多聚甲醛过夜固定,之后用石蜡包埋,在乳头肌水平制作成石蜡切片。马松三色染色法是用来了解心脏纤维化程度的方法。染色后的片子在放大400 x的显微镜下观察,通过计算心室中心肌内纤维化的面积比例来评价小鼠心肌纤维化的程度。4.组织免疫荧光收集好小鼠心脏组织标本,用4%多聚甲醛过夜固定,之后用石蜡包埋组织制作成切片后,将切片进行脱蜡、水化,抗原修复和封闭。随后,将切片上的组织与适当的一抗在4℃孵育过夜,第二天选用FITC(绿色荧光)或者Cy3(红色荧光)标记的二抗在37℃孵育60min。用α-actinin来表示心肌细胞。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。染色后切片的观察和图像的采集通过荧光显微镜来完成。5.DCFH检测通过荧光指示剂DCFH来测定ROS水平。当把DCFH加到组织匀浆中,匀浆中ROS会使得DCFH氧化,生产荧光的DCF。将1uM的DCFH和1毫升含10ug心肌胞浆蛋白一起孵育1h后,使用900Hi型全自动恒温酶标仪在485 nm的激发波长和535 nm的发射波长下进行检测。6.蛋白羰基化实验将心室组织在(蔗糖0.3M,烟碱0.03M和EDTA 0.02M,pH 7.4)液体里匀浆,之后将组织匀浆液在4℃离心机中以10000g离心5 min。每500ul体积中含100ug的胞浆蛋白,和2mM的DNPH常温避光孵育1h。最后将DNPH处理的蛋白,采用Western blot的方法检测蛋白质的羰基化反应。7.蛋白质印迹收集24个月大的老龄小鼠心脏,提取蛋白通过Western blot的方法检测p16,p53,LC3,p62,PINK1,Parkin等蛋白水平。GAPDH作为蛋白质印迹的内参,每组n=3。8.统计分析所有数据以平均值±标准差表示。组间比较采用t检验或者单因素方差分析,数据运用SPSS13.0软件进行统计学分析,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.HSP27减轻由年龄引起的心脏衰老1.1心肌特异性表达HSP27的鉴定我们成功构建心肌特异性表达人HSP27基因的转基因小鼠,通过Western blot分析来确认,在Tg小鼠心脏中HSP27表达丰富,而野生型对照组中则不表达(HSP27抗体不与小鼠的HSP25交叉反应)。1.2 HSP27对衰老心脏心功能的影响与年轻的WT小鼠相比,老年的WT小鼠的E/A比值减少37.5%,EF(40.0%)和FS(45.9%)明显下降,与此同时LVVd(67.4%)和LVVs(181.0%)明显增加(P0.01)。与年轻的Tg小鼠相比,老年Tg小鼠的E/A比值减少15.4%(P0.05),而老年Tg小鼠的EF,FS,和LVVd较年轻Tg小鼠相比变化不大。但是,与老龄WT小鼠相比,老龄Tg小鼠减缓(37.4%)由于年龄引起的E/A比值减少(P0.05),高龄Tg小鼠较WT小鼠EF、FS明显增加,同时LVVd 和 LVVs 明显降低(P0.01)。2.HSP27减少老年小鼠心肌中衰老标志物的水平在小鼠心肌组织中,与老年WT小鼠相比,老年Tg小鼠的p16和p53的水平分别显著降低46.5%和49.4%(P0.01),老年Tg小鼠的p21表达水平比WT老年小鼠心肌中p21的表达水平显著降低(P0.01)。为了确定p53的激活,我们继续探究在Ser15位点磷酸化的p53磷酸化水平(p-p53)。在老龄Tg小鼠心脏的p-p53水平比老龄WT小鼠心肌组织中的p-p53明显降低(P0.01)。3.HSP27减缓老年小鼠心肌间质的纤维化进程与老龄WT小鼠心脏心肌间质相比,老年Tg小鼠心脏心肌间质纤维化明显减少 76.2%(P0.01)。4.HSP27减少老年小鼠心肌中ROS的含量在老龄的WT小鼠和Tg小鼠的心脏中ROS含量分别为2038.6和752.4个单位,老年Tg小鼠的心脏中ROS含量比老年的WT小鼠显著降低(P0.01)。同时,老龄Tg小鼠心肌的蛋白质羰基化水平(46.1%)明显较老龄的WT小鼠降低(P0.01)5.HSP27提高老龄小鼠心脏中的自噬水平与老龄WT小鼠心脏相比,老年Tg小鼠心脏的LC3-II蛋白水平明显降低38.7%(P0.01),p62蛋白表达水平降低59%(P0.01)。同时老龄Tg小鼠心脏中参与自噬体形成和成熟的蛋白表达水平较WT高龄小鼠显著增加:Atg13(112.7%)、Vps34(68.5%)、和 Rab7(138.4%)(P0.01)。6.HSP27减少泛素结合蛋白的含量高龄的Tg小鼠心脏的蛋白质的泛素化水平(76.2%)比高龄的WT小鼠显著降低(P0.01)。7.HSP27增加PINK1和Parkin在老龄心脏中的表达水平与老龄的WT小鼠心脏相比,老龄Tg小鼠心脏中PINK1和Parkin的表达水平分别增加了 57.1%和60.5%(P0.01),高龄Tg小鼠心脏中BNIP3表达水平明显高于高龄WT小鼠(P0.05)。而Nix蛋白的水平在两组基因型不同的高龄小鼠中表达相差不大。结论HSP27可以改善高龄化引起的心脏功能下降,其保护机制涉及抗氧化和线粒体自噬的激活。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【相似文献】