不同复苏方案对继发性腹腔高压症肠道损害的作用和机制研究

发布时间：2018-03-01 16:57

本文关键词： 腹腔高压症紧密连接褪黑素 p38 MAPK　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景与目的:正常人的腹腔内压力(Intra-Abdominal Pressure,IAP)为0-5mm Hg,当IAP达到或者超过12mm Hg时,定义为腹腔高压症(Intra-Abdominal Hypertension,IAH)。继发性IAH是指由非起源于盆腹腔的病变所导致的IAP的升高,通常见于创伤、烧伤、脓毒症、休克等需要大量补液的患者。继发性IAH发生的病理生理过程主要表现为缺血再灌注损伤,在此过程中大量炎症因子释放、肠道通透性增高、液体渗漏、肠管缺血水肿并最终导致继发性IAH。继发性IAH病情危重,死亡率高。因此,如何在对患者实施复苏时降低继发性IAH的发生是防治的重点。褪黑素(Melatonin,MT)是由松果体合成并分泌的一种激素,在体内具有强大的抗氧化的作用,可通过清除自由基、增强抗氧化酶活性等作用来对抗氧化应激损伤。近年来,MT对炎症反应的调控作用也受到人们的关注,且外源性MT被证实可通过抑制炎症反应来发挥其脏器保护作用。因此,能否通过在复苏时使用外源性MT来抑制炎症反应、降低肠道的缺血再灌注损伤而减少肠道损害、降低继发性IAH的发生?本课题通过对SD大鼠实施失血性休克后过量液体复苏来构建继发性IAH的大鼠模型,并在此模型的基础上对比使用MT、7.5%高渗盐溶液(Hypertonic Saline,HS)和羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch,HES)联合LR来实施复苏的方案对继发性IAH的治疗、预防作用的优劣,明确各类复苏方案对肠屏障功能的保护效能。最后通过筛选分析信号通路研究,明确这些复苏方案发挥保护作用所调控的信号通路的具体情况。主要实验方法与实验步骤:1.继发性IAH大鼠模型的建立及其发生机制通过对SD大鼠制作门静脉恒定缩窄、股动脉放血导致失血性休克、腹部放置束缚装置后,再使用乳酸林格氏液(Lactated Ringer's Solution,LR)(30ml/h×6h)进行复苏,能成功构建SD大鼠的继发性IAH模型,并通过酶联免疫吸附实验,高效液相色谱检测,蛋白质免疫印迹实验,免疫荧光组织化学染色和电镜等方法来论证在构建继发性IAH过程中肠道通透性及紧密连接蛋白的变化情况。2.不同复苏方案对继发性IAH复苏效果的对比研究在先前构建的继发性IAH的大鼠模型的基础上,通过在复苏开始阶段使用MT、HS、HES对实验动物进行治疗,然后再使用LR进行液体复苏,我们通过酶联免疫吸附实验,高效液相色谱检测,蛋白质免疫印迹实验,免疫荧光组织化学染色和电镜等方法对比观察这些方案在预防继发性IAH中对肠道通透性、紧密连接的保护效果。3.MT对继发性IAH肠道损害保护作用及其机制研究为进一步探明褪黑素保护效果的潜在机制,我们采用免疫印迹实验来分别检测信号转导子和转录激活子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT)信号通路和核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-кB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)信号通路,这三个信号通路的变化情况。同时,我们还通过在复苏开始阶段使用p38 MAPK的阻滞剂(SB203580)来观察肠道损害的情况,明确MT是否通过影响p38 MAPK来发挥其对肠道的保护作用。主要研究结果:1.成功建立继发性IAH的大鼠模型立通过对SD大鼠采用恒定的门静脉缩窄,腹部使用束缚带,失血性休克2h后实施LR复苏6h,复苏结束后的IVCP为(20.99±3.50)mm Hg,均达到继发性IAH的诊断标准。同时在继发性IAH的发生过程中,肠道炎症反应、氧化损伤加剧,通透性增高,紧密连接被破坏,紧密连接蛋白表达下降。2.MT对继发性IAH肠道损害的保护作用显著通过通过对比使用MT+LR、HS+LR和HES+LR进行复苏,我们发现,这些方案与单独应用LR相比均能够降低继发性IAH的发生率,同时还能降低肠道通透性、保护肠道上皮细胞间的紧密连接、抑制炎症反应和氧化损伤。而在这三类方案中,MT+LR的效果则更为显著,在复苏结束时无一动物达到继发性IAH的诊断标准。3.MT发挥继发性IAH肠道损害后的保护作用的机制研究本部分实验通过检测并对比MAPKs,STATs和NF-кB这三类信号通路,发现STAT-1、STAT-3信号通路,ERK1/2、JNK信号通路虽然有改变,但是不具有统计学意义。NF-кB p65和p38 MAPK信号通路的变化显著,但是p38 MAPK信号通路的变化趋势更加明显,揭示了MT可能通过调控p38 MAPK信号通路来发挥其保护作用。通过应用p38 MAPK信号通路的阻滞剂SB203580进一步发现,MT对继发性IAH的保护效应可能依赖于抑制p38 MAPK信号通路来实现。结论:1.通过制作门静脉恒定缩窄、腹部放置束缚装置后,股动脉放血导致失血性休克(40mm Hg×2h),再使用LR进行复苏,能成功构建大鼠的继发性IAH模型。同时还证实在继发性IAH过程中,缺血再灌注损伤所诱发的炎症反应和氧化应激并由此导致的肠屏障紧密连接的破坏、肠道通透性增高为基本的病理生理变化。2.与单独应用LR复苏相比,在复苏阶段使用MT+LR、HS+LR和HES+LR进行复苏,可以抑制肠上皮细胞的炎症反应,降低其氧化损伤,从而降低肠道通透性,减轻肠道水肿,降低继发性IAH的发生,而其中MT的保护效果则更为显著。3.褪黑素可能通过阻滞p38 MAPK信号通路来发挥对继发性IAH过程中肠道损害的保护作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.7

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