高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在多发性骨髓瘤耐药中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-07 16:29

本文选题：多发性骨髓瘤　切入点：耐药　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖性疾病,临床表现主要包括高钙血症、肾功能受损、贫血及溶骨性病变。目前MM发病率居血液系统恶性肿瘤第二位,仅次于淋巴瘤。MM的治疗药物主要包括传统化疗药及新药,随着新药(硼替佐米、雷那度胺等)及自体干细胞移植的应用,MM患者的生存已经得到极大的改善和提升,但由于原发及继发耐药的发生,大部分MM患者最终进展复发,使MM目前仍不可治愈。因此进一步探究MM的耐药机制,寻找克服耐药或增加药物敏感性的方法,是临床上迫切需要解决的问题。高迁移率族蛋白B1(high-mobility groupboxl,HMGB1)作为一种非组蛋白染色体结合蛋白,在DNA重组、修复及靶基因转录中起重要作用,同时HMGB1能够被分泌或释放至细胞外作为一种损伤相关模式分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)与其受体结合参与炎症、细胞分化、细胞迁移、血管生成及肿瘤转移、耐药等。研究发现HMGB1在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤侵袭、转移及耐药,在血液系统恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤中也发现有HMGB1的过表达,化疗药物促进白血病细胞释放HMGB1,从而使其拮抗凋亡,同时HMGB1还能够通过增加自噬诱导白血病细胞的耐药。TLR4是HMGB1的重要受体之一,HMGB1能够通过结合TLR4参与炎症、血管生成、肿瘤生长及转移等过程。我们前期研究发现TIR4的外源性配体脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能够通过与TLR4结合活化MM细胞内NF-1κB和MAPK信号途径,促进MM细胞增殖,同时能够抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。而在进一步研究中我们发现MM细胞能够分泌TLR4的内源性配体HMGB1。作为染色体结合蛋白及损伤相关模式分子,HMGB1是否介导MM耐药的发生并不清楚,因此本研究拟在前期工作基础上深入探索HMGB1在MM耐药中的作用及机制。研究目的:1.明确原代MM细胞及MM细胞系中HMGB1的表达及分泌情况;2.构建干扰HMGB1的慢病毒载体转染MM细胞,明确内源性HMGB1在MM生长及耐药中的作用;3.分析化疗药物处理后MM细胞培养上清中HMGB1的变化,明确外源性HMGB1对MM细胞生长及耐药的影响;4.体外及体内实验探索HMGB1介导MM耐药的机制。研究方法:1.利用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光技术及流式细胞分析术检测MM患者原代标本及 MM 细胞株(MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929)中HMGB1及其受体的表达情况;ELISA方法检测MM患者骨髓上清中HMGB1的分泌情况及化疗药物处理后细胞培养上清中HMGB1的变化;2.用外源性重组蛋白HMGB1(rhHMGB1)预处理MM细胞,利用MTT、CCK-8、流式细胞分析术检测外源性HMGB1对MM细胞增殖及药物诱导凋亡的影响;3.慢病毒载体构建干扰HMGB1的MM细胞株(RPMI8226、CAG、MM.1S、ARK),利用CCK-8、流式细胞分析术、Western blot检测内源性HMGB1对MM细胞增殖及药物诱导凋亡的影响;4.基因表达谱芯片筛选干扰HMGB1的MM细胞及其对照MM细胞中的差异基因,qRT-PCR及Western blot验证芯片结果,并进一步探索相关信号通路的变化及其对MM细胞耐药的影响;5.通过NOD/SCID小鼠皮下注射HMGB1干扰及对照组MM细胞(MM.1S-HMGB1 shRNA 及 MM.1S-control shRNA)构建 MM 移植瘤小鼠模型,测量小鼠肿瘤体积同时免疫组织化学方法检测肿瘤组织中相关蛋白的表达。研究结果:1.Western blot、qRT-PCR结果显示HMGB1 在MM细胞株MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929及原代MM细胞(患者骨髓CD138+细胞)中均表达,qRT-PCR及流式细胞术结果显示MM细胞株及原代MM细胞差异性表达HMGB1受体RAGE、TLR2、TLR4和TLR9,ELISA检测结果显示MM细胞株及MM患者骨髓上清中均存在HMGB1的分泌;免疫荧光结果显示MM患者骨髓中CD138+浆细胞表达HMGB1;2.硼替佐米(bortezomib,Bor)及阿霉素(Adriamycin,ADM)能够显著抑制MM细胞的增殖同时伴随MM细胞培养上清中HMGB 1释放的增加;rhHMGB1预处理MM细胞后CCK8结果显示rhHMGB 1对MM细胞的增殖无明显影响;MTT及流式细胞术结果显示rhHMGB1对Bor、ADM及地塞米松(Dexamethasone,Dex)诱导的MM细胞凋亡无明显影响;3.CCK-8法检测细胞增殖结果显示干扰HMGB1后,MM细胞本身的增殖无显著变化,而Dex抑制MM细胞增殖的能力增强(P0.05)。流式细胞术结果显示干扰HMGB1对地Dex诱导的MM细胞周期阻滞无明显影响。Annexin V-APC凋亡分析结果显示干扰HMGB1后Dex、ADM及马法兰诱导的MM细胞凋亡显著增加(P0.05)。Western blot结果显示干扰HMGB1后地塞米松诱导的cPARP及c-Caspase3增加;4.基因表达谱芯片显示干扰HMGB1后的RPMI8226及CAG中MM细胞生长、增殖及凋亡相关基因显著变化,其中MM细胞促生长基因DEPTOR表达下降,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表达下降,qRT-PCR(P0.05)及Western blot验证了上述结果;5.Western blot进一步检测相关信号通路发现干扰HMGB1后MM细胞内mTOR通路活化增加、饥饿诱导的MM细胞自噬减少、Dex诱导的p38MAPK激活增加、NF-1κB通路受抑制;6.Western blot结果显示干扰HMGB1后MM细胞本身及药物诱导的MM细胞内DNA损伤效应蛋白γH2A.X表达水平增加,7.体内小鼠荷瘤结果显示干扰HMGB1后抗凋亡蛋白Bcl-2、mTOR底物蛋白p4EBPl表达下降,pAkt(ser473)、γH2A.X表达增加,同时地塞米松用药后c-caspase3、γH2A.X表达增加,HMGB1干扰组小鼠肿瘤负荷显著低于对照组(P0.05)。结论:1.原代MM细胞及MM细胞株普遍表达HMGB1及其受体,同时能够分泌HMGB1;2.化疗药物能够促进MM细胞培养上清中HMGB1的释放增加,但外源性rhHMGB1对MM细胞的增殖无影响,且不能保护MM细胞免受化疗药物诱导的凋亡;3.干扰HMGB1后MM细胞对化疗药物的敏感性显著增加;4.内源性HMGB1可能通过影响MM增殖凋亡相关基因的表达及相关信号通路的异常调控从而影响MM细胞对化疗药物的反应,参与MM耐药;5.内源性HMGB1可能通过调控MM细胞内DNA损伤修复途径参与MM细胞耐药的发生。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.3

【参考文献】