miR-146b在慢性缺氧致心肌细胞凋亡中的作用及机制的研究

发布时间：2018-03-30 11:56

本文选题：mi　切入点：R-146b　出处：《第三军医大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景20世纪以来,随着筛查和治疗技术的进步,先心病的治愈率显著提升,但是复杂型先心病死亡率仍然很高。紫绀型先心病是较为常见的复杂型先心病。在紫绀型先心病中,心脏血流由右向左分流导致的慢性缺氧是此类先心病共有的病理生理过程。虽然紫绀型先心病的患者长期处于慢性缺氧状态,但他们大多数人能耐受这种缺氧存活,直至合适的手术时期。已有的研究证实,心肌慢性缺氧适应性改变能增强心肌细胞对多种外界刺激的耐受,但这其中的机制并未完全阐明。因此,研究慢性缺氧条件下心肌细胞的适应机制可能为改善临床治疗效果,降低缺氧性心脏病的死亡率做出贡献。MicroRNAs(miRNAs)是内源性,短链单链非编码RNA。mi RNA基因以单拷贝,多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,mi RNA与靶mRNA配对,通过形成诱导沉默复合体(miRISC),抑制mRNA翻译或加速m RNA降解,参与基因转录后水平的调控。miRNA被证实在心脏发育以及疾病的病理进程中都发挥重要作用。例如,mi R-1促进胚胎干细胞向心肌细胞分化,而mi R-133抑制胚胎干细胞向心肌细胞分化。敲除mi R-21促进心肌细胞肥大,而过表达miR-21心肌肥厚反应减弱。过表达mi R-208a将导致心肌肥厚和心律失常。查阅法洛氏四联症mi R-array表达谱差异的文献,我们发现miR-146b在法洛氏四联症高表达。以其他细胞缺氧模型为参考,mi R-146b在肺上皮细胞缺氧情况下高表达。北京安贞医院一组研究人员研究发现,小型猪紫绀性心脏病模型中,mi R-146b在肺组织中高表达。这些结果都提示mi R-146b可能参与慢性缺氧心肌病理改变,其调控的方式还未见报道。核糖核酸酶L(ribonuclease L,RNase L)是2-5A系统成员,属于MX家族。研究表明RNase L诱导依赖caspase级联酶的细胞凋亡。此外,凋亡发生时,RNase L从胞浆移动到线粒体,改变ΔΨM(线粒体膜电位),产生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。敲除RNase L后,相对于未敲除组细胞凋亡明显减少,研究表明这部分是由JNK/c-Jun通路介导的。RNase L也可以通过间接影响IKK-κ和IKK-α影响NF-κB通路。tissue-specificgeneexpressionandregulation(tiger)数据库显示rnaselmrna在心脏组织中高表达,这表明它可能在心肌细胞病理生理进程中起到重要作用。研究目的本实验拟在体内(临床心肌标本)和体外(细胞)两个水平检测慢性缺氧条件下mir-146b的表达变化。在体外心肌细胞慢性缺氧模型中使用抑制剂改变mir-146b的表达,检测改变mir-146b表达对缺氧h9c2心肌细胞的影响。同时通过生物信息学预测并由报告基因实验确认mir-146b的靶基因。随后检测缺氧时下调mir-146b是否导致nf-κb和stat3的激活。最后我们下调靶基因rnasel,研究该基因在心肌细胞慢性缺氧中可能的作用。研究方法本研究分五部分:1.体内(临床心肌标本)和体外(细胞)两个水平检测缺氧对mir-146b表达影响。1.1收集人心肌标本,紫绀组病人患有法洛四联症或肺动脉闭锁合并室间隔缺损,非紫绀组病人患有右室流出道狭窄合并室间隔缺损),标本于手术中取自右室流出道。提取组织rna,采用rt-pcr检测mir-146b在两组病人标本中的表达情况。1.2将同一批次h9c2(大鼠心室肌细胞系)细胞置于低氧培养箱(1.0%o2、5.0%co2)中分别培养24h、48h及72h,对照组置于普通培养箱(21.0%o2)中培养,利用rt-pcr技术检测在心肌细胞系中随着缺氧时间的延长mir-146b表达情况。2.探索mir-146b在h9c2细胞慢性缺氧中的作用及调控机制:2.1常氧时在h9c2细胞系中转染带绿色荧光的阴性对照,通过荧光显微镜观测转染效率。2.2向部分h9c2细胞中转染化学合成的mir-146binhibitor(后简称146b-inh),建立常氧,慢性缺氧,慢性缺氧+转染146b-inh,慢性缺氧+转染146b-inhnc四个实验组。通过ldh细胞毒性检测,流式annexinv-fitc/pi检测,hoechst染色,tunel染色,jc-1染色这几种实验方法测量各组细胞损伤或凋亡程度,探索下调mir-146b对缺氧心肌细胞损伤和凋亡的影响;利用western-blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspse3,bcl-2和bax在各组中的表达情况;3.利用生物信息学数据库targetscan预测mir-146b的靶基因。构建靶基因rnasel的野生型及突变型双荧光素酶报告基因,将mir-146bmimic或其nc与野生型或突变型报告基因共转染293t细胞,然后利用荧光照度计检测报告基因相对荧光值,以此检测mir-146b与rnaselmrna是否能物理结合;同时采用western-bolt技术,在h9c2细胞系中通过转染146b-inh下调mir-146b后,检测心肌细胞系中rnasel蛋白的表达变化。4.western-bolt检测转染mir-146binhibitor后缺氧情况下h9c2细胞中nf-κb信号通路关键蛋白p65及其磷酸化形式的表达变化,以及stat3蛋白及其磷酸化形式的表达变化。5.初步研究rnasel在心肌慢性缺氧中的表达及作用:5.1免疫组化检测rnasel在人心肌组织中的表达情况。5.2在前述1.2构建的慢性缺氧心肌细胞模型中,利用rt-pcr及western-bolt技术检测缺氧后rnaselmrna和蛋白的表达变化,以及rli蛋白表达变化。5.3设计并化学合成rnaselsirna,转染h9c2细胞,利用rt-pcr方法检测干扰效率,选取有效的sirna干扰序列。5.4利用流式annexinv-fitc/pi检测缺氧情况下转染rnaselsirna对凋亡的影响;实验结果1.rt-pcr结果显示mir-146b在紫绀型和非紫绀型先心病病人标本表达存在显著差异,前者是后者的1.40倍(p0.05)。2.rt-pcr结果显示在h9c2心肌细胞中mir-146b的表达量随着缺氧时间的延长而逐渐增加,并在72h达到顶峰,达到常氧对照组的1.97倍(p0.05)。3.将inhibitor荧光阴性对照转染h9c2细胞,荧光显微镜观测结果显示转染效率达到75%以上。心肌细胞转染mir-146b化学模拟物或抑制剂后缺氧72h,ldh细胞毒性实验结果显示,转染mir-146bmimic可显著减少细胞死亡(死亡率下降20.3%,p0.05),而转染mir-146binhibitor则起到相反的结果(死亡率升高64%,p0.05)。我们接着利用流式annexinv-fitc/pi,tunel染色,hoechst染色及jc-1染色检测缺氧心肌凋亡情况,结果显示与nc组相比,转染mir-146binhibitor均能显著增加细胞凋亡(所有p0.05)。同时western-blot结果显示转染mir-146binhibitor后,cleaved-caspase3、bax的蛋白量显著增加(分别升高73.0%和72.8%,p0.05),而bcl-2的表达下降37.2%(p0.05),bcl-2/bax也有明显降低(下降64.0%,p0.05)。4.双荧光素酶报告基因结果显示共转染mimic与野生型报告基因后可显著降低荧光强度(下降30.9%,P0.05),而共转染突变型报告基因与mimic则没有这种差异(P0.05)。同时在H9c2细胞中转染mi R-146b inhibitor后,RNase L蛋白表达增加6.61倍(P0.05)。5.H9c2心肌细胞转染mi R-146b抑制剂后缺氧培养72h,Western-Blot结果显示转染miR-146b inhibitor并没有改变p65和STAT3蛋白表达(P0.05),但这两个蛋白的磷酸化水平显著增加,分别为对照组的2.2倍和1.27倍(P0.05)。6.免疫组化结果显示在人心肌组织标本中,RNase L高表达于心肌细胞及成纤维细胞,而较低表达于间质细胞(如血管内皮细胞)。7.利用RT-PCR和Western-Blot检测发现心肌细胞缺氧后,RNase L m RNA和蛋白表达逐渐下调(RNase L m RNA缺氧72h与0h相比下降61.0%,P0.05),而它的抑制因子(RLI)蛋白表达增加。8.利用RT-PCR检测沉默效率,发现设计的3对RNase L si RNA仅1对能有效沉默靶标基因,使RNase L m RNA水平下调52.3%(P0.05)。在H9c2细胞中干扰RNase L表达后置于缺氧孵箱中培养72h,流式Annexin V-FITC/PI检测缺氧心肌的凋亡,结果显示RNase L si RNA转染组中凋亡细胞数量低于对照组(4.36%vs.NC 12.4%)。结论1.在病人心肌标本中,紫绀组mi R-146b表达高于非紫绀组,同时在体外慢性缺氧H9c2细胞模型中,随着缺氧时间延长mi R-146b表达缓慢上升。2.在H9c2细胞系中,下调mi R-146b可显著增加缺氧所致的心肌凋亡。3.生物信息学预测,同时双荧光素酶报告基因和Western-Blot实验证实RNase L为mi R-146b靶基因4.并且在心肌慢性缺氧模型中下调mi R-146b表达,NF-κB信号通路激活增加,STAT3磷酸化水平增加。5.RNase L蛋白在人心肌组织中表达,高表达于心肌细胞及成纤维细胞,而较低表达于间质细胞。H9c2细胞缺氧后RNase L在mRNA及蛋白水平都随着缺氧时间延长逐渐降低,而RLI蛋白表达对应增加。下调RNase L表达,缺氧导致的心肌凋亡减少。其具体的作用机制有待进一步研究。
[Abstract]:In the 20th century , with the progress of screening and treatment technology , the cure rate of congenital heart disease is obviously improved , but the mortality of complex congenital heart disease is still high . The effect of mir - 146b on the expression of NF - 魏B and stat3 in cardiac muscle cells was studied . Conclusion : 1 . The expression of RNase L in human cardiac muscle tissue is higher than that of non - cyanosis group .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.1

【相似文献】