真核起始因子6在增生性瘢痕及肾纤维化中表达规律的临床研究

发布时间：2018-04-09 08:56

本文选题：eIF6　切入点：增生性瘢痕　出处：《第三军医大学》2015年博士论文

【摘要】：纤维化疾病是全球发病率与死亡率的主要原因,它改变组织及器官的正常结构,从而扰乱正常的功能。纤维化疾病能够影响几乎所有的器官,并与各种疾病及损伤相关联。纤维化疾病常见于肝脏、肺脏、心脏、肾脏以及皮肤,是全球重大的疾病负担。烧伤常常导致增生性瘢痕,排名全球纤维化疾病负担的第15位。大多数器官纤维化的主要特征包括肌成纤维细胞的增多、分化及持续存在、胶原沉积与降解失衡以及挛缩增加。增生性瘢痕是纤维化疾病的一种,是皮肤损伤后创面修复过程异常反应而导致的病理性愈合。皮肤损伤后,一系列细胞、细胞外基质以及细胞因子在创面修复各个阶段(炎症期、肉芽形成期以及组织重塑期)中发挥不同的作用。创面愈合的组织重塑期可能持续数月甚至数年之久。在创面修复的三个阶段,抗纤维化分子和促纤维化分子如生长因子、蛋白水解酶、细胞外基质等相互作用。无论是成纤维细胞产生过度的胶原、糖蛋白及纤粘蛋白,还是细胞外基质的降解及重塑缺失,都将导致细胞外基质的沉积与降解微平衡被破坏。创面持续的炎症反应导致的增生性瘢痕,其特点是血管生成、细胞增多以及过度的胶原沉积。肾纤维化是慢性肾脏疾病的最终结局,其病理特点是肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管萎缩、肾小管周围毛细血管稀疏以及炎性浸润等。这些变化最终将导致肾实质结构彻底破坏以及肾功能衰竭。有研究证实了肌成纤维细胞在肾纤维化疾病中的重要作用,因为其不仅导致细胞外基质的过度沉积,还产生炎性因子及有毒氧基。肌成纤维细胞在上述条件下的肾间质空隙中密集地积累并不断合成基质成分,同时破坏肾实质以及微血管。目前,已经证实能够促进肾脏纤维化的因素包括上皮损伤、炎症、先天以及适应性免疫反应。此外,也有研究发现间质细胞向肌成纤维细胞转分化中的多种分子信号途径与肾脏纤维化密切相关,如转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF),结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF),表皮生长因子(epidermal growth factor,egf),hedgehog(hh),gli,wnt以及notch等。在前期研究中,我们通过基因差异表达筛选出与瘢痕增生的相关基因p311,而eif6(integrinβ4bindingprotein,genbankidnm_002212)是其相互作用蛋白。与皮肤来源成纤维细胞相比,增生性瘢痕来源的成纤维细胞中eif6表达降低。在小鼠皮肤创面愈合过程中,eif6的低表达导致了创面修复过程中tgf-β1和α-sma表达上调,肉芽组织过多形成,创面收缩的增强;在小鼠肾脏纤维化过程中,低表达eif6加速了小鼠肾纤维化进程,增强了tgf-β1的表达,促进了成纤维细胞和肾小管上皮细胞等向肌成纤维细胞分化。基于eif6参与胎儿皮肤发育、能够抑制肌成纤维细胞的表型逆转、抑制纤维化动物模型的创面纤维增生及肾脏纤维化的作用,我们提出eif6可能是纤维化的负性调节因子。eif6(又名eif6,p27bbp)是s.biffo等人在1997年利用酵母双杂交系统研究beta4整合素结合蛋白时发现的一种进化高度保守的蛋白,由单基因编码。eif6是一种核糖体抗结合因子,能够调节核糖体60亚基的活力以及80s亚基的形成,从而调控蛋白质翻译的起始过程以及核糖体的合成。northern分析及原位杂交证明eif6mrna在体内高表达于人类上皮细胞系和小鼠胚胎的增殖胚芽上皮细胞中。至此之后不同的研究所对其基因、表达、结构及其生物学作用均作了研究。eif6mrna长度是1108bp,其开放阅读框包含735核苷酸。荧光原位杂交技术证实了eif6的基因位于21号染色体长臂20q11.2区域,包含7个外显子和6个内含子,并且没有tata盒结合结构域以及cpg岛。在真核细胞中,eif6呈保守表达方式,不仅表达于人类、小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾等脊椎动物,还表达于果蝇、乌贼等无脊椎动物,并且在脊椎动物与无脊椎动物中eif6的结构域高度保守。在转录及转录后,基因转变成为成熟的mrna,然后在细胞浆中在核糖体翻译成为多肽链。在真核细胞的生长与分化过程中,只有部分基因能够表达,大部分基因都是以沉默状态存在的。多个水平的mrna翻译调节对蛋白质翻译均有重要作用,尤其在蛋白质翻译的起始阶段。在细胞核内,eif6结合核糖体60s亚基,抑制80s亚基的合成,在蛋白翻译的起始阶段扮演真核启动因子的角色。eif6在ck1-pkc的磷酸化作用下,核糖体60s与eif6解离,随后与核糖体40s亚基结合形成80s。最终,蛋白质的合成启动。与之相反的是,如果eif6缺失,microrna对目的蛋白的抑制减轻,目的蛋白的表达加强。eif6蛋白的合成与microrna的调节相关,通过eif6与risc结合,促进相关microrna的功能,mrna形成在转录水平受到干扰,目的蛋白合成抑制。研究表明,eif6不仅作为β整合素4的连接蛋白表达在胞浆内,还在胞核内表达,与核糖体60s结合,eif6-60s复合物转运出细胞核后,在胞浆内通过rack1-pkcβii途径释放,与40s装配形成80s,从而启动了蛋白的合成。eif6持续表达于人类和墨鱼的上皮细胞、成纤维细胞以及肌纤维等组织内。在含有beta4整合素的上皮细胞中,eif6存在于胞浆区的半桥粒附近,与角蛋白中间丝结合,推测其可能为beta4整合素与细胞骨架胞的分子连接,与细胞骨架的形成相关。eif6同样表达于核仁,是一种核基质相关蛋白,参与形成核基质纤维,eif6在体外以管家基因表达特性的方式持续稳定表达,而在体内却受到高度调控,免疫组织化学分析显示,同一器官或组织中的eif6表达具有细胞类型特异性,这种调节可能与组织特异性因子和蛋白合成途径相关。在nih/3t3、jurkat、sk-n-mc、a431、hela、hacat、fg2和rin2a等细胞系以及人类原代成纤维细胞(脐带来源)和小鼠静息期脾细胞中均能检测到eif6的持续性表达,eif6的缺失将导致g1细胞的累积,且与自由60s核糖体亚单位的丢失相关。已经证实,p311是促进增生性瘢痕的细胞因子之一。在我们的前期研究中通过酵母杂交技术及荧光共振能量转移筛选发现,eif6是p311的结合蛋白,可能通过相反的作用影响增生性瘢痕的形成。在增生性瘢痕源性成纤维细胞中,eif6的表达较正常皮肤来源的成纤维细胞减低。在eif6敲降的小鼠单侧输尿管结扎模型中,eif6的减少可以增加肌成纤维细胞的活化,增加胶原、α-sma以及tgf-β1的表达,从而促进纤维化的发生与发展。然而,由于eif6在高表达于周期细胞中,并且在体内的表达受到高度调控,因此,在人增生性瘢痕及慢性肾小球肾炎中的表达是否与体外实验一致尚不明确。因此,本研究拟分为以下三个方面研究eif6在烧伤病人不同时期增生性瘢痕中以及慢性肾小球肾炎肾小管/肾间质纤维化中在时间与空间的表达规律:1)eif6在不同时期增生性瘢痕与同体正常皮肤的表达分布差异;2)eif6在不同时期增生性瘢痕与同体正常皮肤的表达含量差异;3)eif6在肾小管/肾间质纤维化肾脏疾病组织中的表达分布特点及其与正常肾脏组织的差异。1、eif6在不同时期增生性瘢痕及正常皮肤组织中的表达分布差异首先,我们收集烧伤后不同时期增生性瘢痕以及同体正常皮肤组织样本,通过免疫组织化学染色检测eif6在其中的表达分布规律。结果发现:在正常皮肤组织中,eif6主要分布于包括基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角化层的角质形成细胞,其表达部位在细胞胞浆。与之不同的是,在增生性瘢痕中,虽然eif6同样主要分布于表皮层,但其表达的强度明显低于正常皮肤组织,更重要的是eif6在表皮的基底层的表达是阴性的。成熟期的瘢痕组织中,eif6的表达强度比增生期瘢痕有增高,但仍低于正常皮肤组织,在其分布上,基底层有少量eIF6阳性细胞。消退期瘢痕组织中,尽管eIF6的表达强度仍低于正常皮肤组织,但明显高于增生期,且其表皮基底层有较多的e IF6阳性细胞分布。2、e IF6在不同时期增生性瘢痕与同体正常皮肤的表达含量差异本实验对所收集烧伤后不同时期增生性瘢痕以及同体正常皮肤组织样本中的eIF6表达量进行Western Blot定量分析。结果显示:与正常皮肤组织相比,增生性瘢痕组织瘢痕中eIF6的表达量显著下调,这种下调的程度在增生期的瘢痕组织中最为显著。虽然与正常皮肤组织相比,消退期瘢痕中eIF6的表达量仍是降低的,但较增生期的瘢痕有明显的增加,这说明了eIF6的表达与增生性瘢痕形成有关联,结合临床上增生性瘢痕从增生期开始增生、成熟期稳定、消退期逐渐消退的过程,以及基础研究结果提示eIF6通过TGF-β/Smad信号通路影响肌成纤维细胞的活化与分化,提示eIF6在人增生性瘢痕形成过程中的负性调控作用。3、eIF6在慢性肾小球肾炎纤维化肾脏组织中的表达分布差异收集不同纤维化程度的慢性肾小球肾炎肾脏穿刺标本,以中度及重度纤维化肾脏为实验组,以相对正常的肾脏穿刺标本为对照组,分别检测其eIF6的表达分布情况。结果显示:在正常肾脏中,e IF6表达于肾小球、肾小管上皮细胞以及肾间质细胞即:e IF6表达于肾皮质肾小球球囊上皮细胞、近端小管、远端小管上皮的细胞胞浆。此外,肾间质细胞也有eIF6的阳性表达。而在慢性肾小球肾炎肾小管间质纤维化的肾脏组织中,e IF6的总体表达较弱,肾小球球囊上皮细胞中未见e IF6的表达,肾小管上皮中e IF6的表达较正常肾小管上皮细胞弱。大多数纤维化肾脏组织中皮质区肾小管间质区域增宽,在该区域中e IF6的表达也是阴性,但纤维化旁的近端小管、远端小管上皮细胞中eIF6的表达强于正常肾脏组织。综上所述:通过检测不同时期的增生性瘢痕中eIF6的表达分布与表达量的差异,我们发现在增生性瘢痕中eIF6的表达量低于正常皮肤,且e IF6的表达分布和表达量与增生性瘢痕的发展过程相关联。在肾纤维化组织中,e IF6的表达分布比正常肾脏组织有差异,结合前期在单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾纤维化模型中我们发现eIF6的减少可促进胶原、TGF-β1和α-SMA的表达明显增加,说明eIF6参与了人慢性肾小球肾炎纤维化的过程。所以,eIF6可能参与人体多种组织纤维化的过程,可能是未来我们调控纤维化疾病的治疗靶点。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

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