生长激素对人源化小鼠中人造血免疫系统形成的影响

发布时间：2018-04-15 01:12

本文选题：人源化小鼠 + 重组人生长激素　；参考：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：研究目的:种属间的差异导致通过传统动物模型无法准确预测人类生理、病理情况并有效评价药物临床效果。在免疫缺陷小鼠上共移植人胚胎胸腺和人胎肝造血干细胞建立的具有人免疫系统的人源化小鼠模型被国际公认为当前整体研究人类免疫学问题以及相关疾病的最有效工具之一。然而,由于小鼠分泌的某些造血免疫发育相关因子和人细胞无反应或反应弱,人源化小鼠中的人免疫系统组成和功能还不完善,需要进一步优化。作为神经内分泌系统的重要一员,生长激素(growth hormone,GH)已被体外实验与小鼠体内实验证明同胸腺发育、骨髓中淋巴造血细胞分化都有密切联系。有研究表明,小鼠生长激素(mouse growth hormone,mGH)与人体细胞的生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)激活无交叉反应,这可能成为限制人源化小鼠中人免疫系统的重建和功能的潜在因素。因此,研究人生长激素对人源化小鼠中人造血免疫系统的影响及其作用机制,并据此优化人源化小鼠模型的构建方案具有重要意义。本研究以期通过重组人生长激素(recombinant huamn growth hormone,rhGH)优化人源化小鼠人免疫系统的重建。同时,借助人源化小鼠模型,探究rhGH对人胚胎造血干细胞(human hematopoietic stem cell,hHSC)及各造血免疫细胞亚群体内增殖分化的影响。研究方法:(1)体外建立造血干细胞扩增体系,利用BrdU试剂盒检测并比较不同浓度rhGH单独或联合造血干细胞因子(stem cell factor,SCF)时对造血干细胞扩增效率的影响。(2)构建人源化小鼠模型:通过免疫磁珠分选方法分选出人胚胎肝脏内的CD34+造血干细胞并检测纯度。亚致死剂量照射免疫缺陷小鼠——NCG小鼠,进一步清除小鼠的造血免疫组织。将造血干细胞以尾静脉注射方式移植到NCG小鼠体内。(3)在人源化小鼠构建第3周、6周、9周时检测人源化小鼠体内的人造血免疫细胞水平。主要检测人白细胞(whitebloodcell,wbc)、髓系细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、树突状细胞、红细胞占外周血总细胞及人免疫细胞比例。在人源化小鼠重建10周后处死小鼠,检测小鼠外周血(peripheralblood,pb)、脾脏、骨髓(bonemarrow,bm)中上述细胞比例。同时,检测小鼠外周血、脾脏、骨髓、胸腺中t淋巴细胞及其亚群比例:检测辅助性t细胞(thelpcells,th)、细胞毒性t细胞(cytotoxictcells,tc)比例;静息t细胞、效应t细胞;中枢记忆性t细胞(centralmemorytcells,tcm)、效应记忆性t细胞(effectormemorytcells,tem)、终末分化t细胞(terminaldifferentiationaltcells,ttd)比例;及胸腺新产生的辅助性t细胞比例;检测小鼠外周血、脾脏及骨髓中分化发育各阶段b淋巴细胞比例:b细胞祖细胞(pro-b)、b细胞前体细胞(pre-b)、未成熟b细胞(immature-b)、成熟b细胞(mature-b)比例;检测骨髓中红细胞及其发育各阶段的亚群比例:较幼稚的大红细胞、较成熟的小红细胞;及根据cd71和cd235a表面标志物区分的原红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞和成熟红细胞红细胞比例。(4)利用流式细胞术检测经rhgh体外扩增的hhsc以及人源化小鼠骨髓内重建的hhsc中,具有持续多潜能性的hhsc比例变化。(5)利用连续移植hhsc构建人源化小鼠的方法验证rhgh对造血干细胞持续多潜能性的影响。通过将人源化小鼠骨髓内重建的cd34+的hhscs作为移植物,移植到另一批免疫缺陷小鼠体内,构建人源化小鼠二次移植模型。评价rhgh处理对hhsc在人源化小鼠体内二次重建人免疫造血系统能力的影响。研究结果:(1)体外造血干细胞扩增中,rhgh组造血干细胞的扩增效率明显弱于scf组。不同浓度的rhgh对造血干细胞的作用结果不同,低浓度(10ng/ml)组可促进造血干细胞增殖,中等浓度及高浓度rhgh未表现出促增殖作用,亦不表现抑制作用。低浓度rhgh协同scf可进一步提高造血干细胞的增殖效率。(2)在构建人源化小鼠后,rhgh组小鼠状态恢复更快,骨髓he染色发现rhgh组造血组织结构恢复较快。在构建后第3周、第6周、第9周检测到rhgh组外周血中表达cd45的白细胞比例明显增加,约为对照组的2倍。各免疫细胞亚群细胞数增加,且在人白细胞中比例与PBS组无明显差异。在构建第10周检测脾脏及骨髓中结果与外周血中趋势一致。(3)构建人源化小鼠第10周检测小鼠脾脏、外周血、胸腺及骨髓中T细胞及其各亚群比例,rhGH组胸腺新产生的辅助性少于对照组,其余T细胞亚群比例与PBS组均无差别。(4)构建人源化小鼠第10周检测小鼠脾脏、外周血及骨髓中B细胞及其发育各阶段细胞亚群的比例,rhGH组人B细胞重建水平更高。骨髓中Pro-B细胞比例高于对照组,其余分化各阶段细胞无明显差异。外周血及脾脏中,rh GH提高了Pro-B细胞和Pre-B细胞在较幼稚的细胞的比例。(5)构建人源化小鼠第10周时检测骨髓中人红细胞及其发育各阶段细胞亚群比例:rhGH组骨髓中人红细胞重建水平更高,较幼稚的大红细胞比例增加,且原红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞比例均高于对照组,而网织红细胞和成熟红细胞比例在两组间无差异。外周血中未检测到人红细胞。(6)rhGH体外促进造血干细胞增殖时,其中具有持续多潜能性的hHSC比例与对照组相比未发生变化,人源化小鼠骨髓内造血干细胞持续多潜能性检测得到相似结果。二次移植hHSC的人源化小鼠人免疫系统重建在两组均可实现。研究结论:rhGH可促进人胚胎造血干细胞增殖及人源化小鼠体内造血免疫系统的重建,并且不影响人胚胎造血干细胞的持续多潜能性,最终优化人源化小鼠模型:(1)rhGH可促进人源化小鼠骨髓、脾脏及外周血中人白细胞(主要为B淋巴细胞)重建水平,尤其增加较幼稚的B细胞祖细胞和B细胞前体细胞的比例。(2)rhGH可促进人源化小鼠骨髓内人红细胞的重建,尤其是较幼稚的原红细胞、中幼红细胞及晚幼红细胞的重建。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R-332;R392

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