生物钟基因Bmal1调控自噬在高糖诱导心肌损伤中的作用及机制

发布时间：2018-04-19 09:25

本文选题：生物钟 + Bmal1基因　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：糖尿病心肌病是糖尿病引起心肌代谢紊乱和心脏微血管病变所致的心肌广泛局灶性损伤坏死,是糖尿病患者高心力衰竭发生率和高死亡率的主要原因,其发病机制非常复杂。高血糖是糖尿病心肌病的独立危险因素,高血糖的持续时间和严重程度与糖尿病心肌病的发生发展密切相关,但目前还缺乏有效的措施防止人类高糖心肌损伤的发生发展。这表明高糖导致心脏毒性仍有其他尚未阐明的发病机制。因此进一步深入探讨其发病机制,寻找更有效的靶向治疗手段,已成为当前糖尿病和心脏病学界亟待解决的问题。自噬是真核细胞内普遍存在的一种降解细胞中损伤或衰老细胞器及生物大分子的分解代谢过程。长期以来,自噬被当做是一种在饥饿和压力等环境中维持能量稳态的生存保护机制。近年来研究发现自噬作为一把双刃剑,它对细胞既可以起保护作用也可以造成细胞损伤,这取决于细胞所处的环境,刺激的强度和性质,以及自噬发生的水平。近年来的研究发现,自噬在糖尿病心肌病发生和发展过程中也扮演着重要角色。但到目前为止,在1型和2型糖尿病整体水平由于自噬受到更加复杂的代谢变化和信号调节,自噬的改变和意义还存在争议。目前单纯针对离体高糖环境中心肌细胞自噬的研究有可能为我们找到糖尿病心肌病新靶点提供线索。近年来研究发现,人或动物的昼夜生物节律被破坏是许多疾病如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等的危险因素。生物钟与地球昼夜循环相适应,是一种生物体内进化保守的基本机制。哺乳动物昼夜节律的产生和维持与生物钟基因的周期性表达有关,生物节律是由一组生物钟基因Bmal1、Clock、Cry和Per等调控。在人体的心脏内生物钟基因呈明显的昼夜节律性,但波动性最明显的是Brain and muscle Arnt-like 1(Bmal1)基因。在生物钟基因形成的自激正负转录反馈环路中Bmal1基因是最主要的启动因子,是中枢和外周节律起搏点的关键组件。Bmal1基因敲除的小鼠表现出完全消失的生物节律性。在链脲霉素诱导的糖尿病模型中,可发现生物钟活性的异常。敲除Bmal1基因可诱发包括糖异生、高脂血症、糖耐量减低等多种代谢异常。因此生物钟基因Bmal1及其靶基因表达异常可能成为糖尿病心肌损伤的新机制。本研究通过制备高糖新生大鼠原代心肌细胞损伤模型,应用分子生物学、细胞生物学等技术,探究生物钟基因Bmal1表达异常对高糖诱导心肌细胞损伤的作用及分子生物学机制。本研究主要包括以下四个部分:第一部分高糖刺激对心肌细胞的作用及其对心肌细胞自噬的影响目的:1构建高糖条件对新生大鼠原代心肌细胞的损伤模型。2观察高糖条件对心肌细胞的作用。3观察高糖条件对心肌细胞自噬活性的影响,为进一步研究奠定基础。方法:取出生2-3天的SD乳鼠,提取并培养原代心肌细胞,分为两组:(1)正常葡萄糖(5.5m M)对照组;(2)高糖(25m M)组。应用Live/Dead染色观察两组细胞死亡情况,通过TUNEL染色和Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3、CARP分析两组细胞凋亡发生情况;并通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5、P62分析心肌细胞自噬情况,LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5蛋白与自噬水平正相关,p62蛋白与自噬水平负相关,并进一步通过应用溶酶体抑制剂巴弗洛霉素(bafilomycin A1,BAF),以ΔLC3-II表示自噬流水平,来更准确的评估两组的自噬活性。结果:1成功建立高糖条件下新生大鼠原代心肌细胞损伤模型。2与正常对照组相比,高糖组死亡和凋亡的心肌细胞明显增多。3高糖组心肌细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC-I、BECN1、ATG12 5水平明显降低,P62水平明显升高,表明高糖组心肌细胞自噬水平明显降低。此外,高糖组的ΔLC3-II水平明显低于正常对照组,更进一步表明高糖条件下自噬受到抑制。结论:1高糖可诱导新生大鼠心肌细胞损伤。2高糖条件下新生大鼠心肌细胞的自噬受到抑制。第二部分生物钟基因Bmal1表达变化对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响目的:1观察大鼠心肌细胞Bmal1基因过表达是否影响及如何影响正常葡萄糖或高糖条件下的心肌细胞损伤。2观察大鼠心肌细胞Bmal1基因低表达是否影响及如何影响正常葡萄糖或高糖条件下的心肌细胞损伤。方法:通过Bmal1 c DNA或sh RNA转染心肌细胞,造成心肌细胞Bmal1基因过表达或低表达,分别以p c DNA或SC sh RNA作为对照组,将转染后的心肌细胞分别置于高糖和正常葡萄糖环境中培养。具体分组如下:(1)Bmal1c DNA+高糖处理组;(2)p c DNA+高糖处理组;(3)Bmal1 c DNA+正常糖处理组;(4)p c DNA+正常糖处理组;(5)Bmal1 sh RNA+高糖处理组;(6)SC sh RNA+高糖处理组;(7)Bmal1 sh RNA+正常糖处理组;(8)SC sh RNA+正常糖处理组。应用Live/Dead染色观察各组细胞死亡情况,通过TUNEL染色和Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3、CARP分析各组细胞凋亡发生情况。结果:1与p c DNA对照组相比,新生大鼠心肌细胞Bmal1基因过表达对正常葡萄糖条件下心肌细胞的存活率、凋亡没有明显差别,但在高糖环境中Bmal1基因过表达明显降低心肌细胞死亡和凋亡。2与SC sh RNA对照组相比,新生大鼠心肌细胞Bmal1基因低表达对正常葡萄糖条件下心肌细胞的死亡和凋亡没有明显影响,但在高糖环境中Bmal1基因低表达明显加重心肌细胞死亡和凋亡。结论:1 Bmal1基因低表达或过表达对正常糖环境中的新生大鼠心肌细胞的死亡和凋亡无明显影响。2 Bmal1基因过表达可显著减少高糖诱导的新生大鼠心肌细胞损伤,Bmal1基因低表达可明显加重高糖诱导的新生大鼠心肌细胞损伤。第三部分生物钟基因Bmal1通过调控自噬在高糖诱导的心肌损伤中发挥作用目的:1观察大鼠心肌细胞Bmal1基因过表达是否影响及如何影响正常葡萄糖或高糖条件下的心肌细胞的自噬活性。2观察大鼠心肌细胞Bmal1基因低表达是否影响及如何影响正常葡萄糖或高糖条件下的心肌细胞的自噬活性。3在观察到新生大鼠在高糖环境中Baml1基因过表达或低表达对心肌细胞损伤及心肌细胞自噬活性的影响的基础上,进一步应用自噬的诱导剂或抑制剂,观察新生大鼠心肌细胞在高糖环境中Bmal1基因低表达或过表达对心肌损伤的影响,以探究大鼠心肌细胞Bmal1基因是否通过调控自噬在高糖诱导的心肌损伤中发挥作用。方法:通过Bmal1 c DNA或sh RNA转染心肌细胞,造成心肌细胞Bmal1基因过表达或低表达,分别以p c DNA或SC sh RNA作为对照组,将转染后的心肌细胞分别置于高糖和正常葡萄糖环境中培养。具体分组如下:(1)Bmal1c DNA+高糖处理组;(2)p c DNA+高糖处理组;(3)Bmal1 c DNA+正常糖处理组;(4)p c DNA+正常糖处理组;(5)Bmal1 sh RNA+高糖处理组;(6)SC sh RNA+高糖处理组;(7)Bmal1 sh RNA+正常糖处理组;(8)SC sh RNA+正常糖处理组。通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5、P62分析心肌细胞自噬情况,并进一步通过应用BAF,以ΔLC3-II表示自噬流水平,来更准确的评估两组的自噬活性。并在此基础上通过进一步应用自噬诱导剂雷帕霉素(Rap)或抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)诱导或抑制自噬,实验分组如下:(1)p c DNA+高糖;(2)Bmal1 c DNA+高糖;(3)Bmal1 c DNA+高糖+3-MA;(4)SC sh RNA+高糖;(5)Bmal1 sh RNA+高糖;(6)Bmal1 sh RNA+高糖+Rap。应用Live/Dead染色观察各组细胞死亡情况,通过TUNEL染色和Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3、CARP分析各组细胞凋亡发生情况。结果:1与pcDNA对照组相比,新生大鼠心肌细胞Bmal1基因过表达对正常葡萄糖条件下心肌细胞的自噬相关蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5、p62和ΔLC3-II没有明显差别,但在高糖环境中Bmal1基因过表达对高糖抑制的心肌细胞自噬具有显著上调作用。2与SC sh RNA对照组相比,新生大鼠心肌细胞Bmal1基因低表达对正常葡萄糖条件下心肌细胞的自噬相关蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5、p62和ΔLC3-II没有明显影响,但在高糖环境中Bmal1基因低表达明显下调心肌细胞的自噬活性。3在高糖条件下心肌细胞Bmal1基因过表达上调自噬的基础上进一步应用3-MA抑制自噬活性后,高糖条件下心肌细胞的凋亡和死亡均明显增多,表明抑制自噬活性可在一定程度上逆转Bmal1过表达对高糖诱导的心肌细胞损伤的保护作用。在高糖条件下Bmal1低表达下调自噬的基础上进一步运用Rap诱导自噬后,心肌细胞的凋亡和死亡显著降低,表明诱导自噬可在一定程度上逆转Bmal1低表达加重高糖诱导的心肌细胞损伤的作用。结论:1 Bmal1基因低表达或过表达对正常葡萄糖环境中的新生大鼠心肌细胞的自噬无明显影响,Bmal1基因过表达可显著上调高糖抑制的新生大鼠心肌细胞自噬,Bmal1基因低表达可明显降低高糖条件下新生大鼠心肌细胞的自噬活性。2 Bmal1是通过调控自噬在高糖诱导的心肌损伤中发挥作用的,Bmal1基因过表达诱导自噬在高糖诱导的心肌损伤发挥保护作用,Bmal1基因低表达抑制自噬则加重高糖诱导的心肌细胞损伤。第四部分生物钟基因Bmal1通过m TOR信号通路调控心肌细胞的自噬活性目的:分析Bmal1调控心肌细胞自噬参与新生大鼠心肌细胞损伤的信号转导机制:1观察新生大鼠在高糖环境中Baml1基因过表达或低表达对m TOR信号通路分子表达的影响;2并进一步诱导或抑制m TOR信号通路活性以观察新生大鼠心肌细胞在高糖环境中Bmal1基因低表达或过表达对自噬的影响。方法:通过Bmal1 c DNA或sh RNA转染心肌细胞,造成心肌细胞Bmal1基因过表达或低表达,分别以p c DNA或SC sh RNA作为对照组,将转染后的心肌细胞分别置于高糖和正常葡萄糖环境中培养。具体分组如下:(1)Bmal1c DNA+高糖处理组;(2)p c DNA+高糖处理组;(3)Bmal1 c DNA+正常糖处理组;(4)p c DNA+正常糖处理组;(5)Bmal1 sh RNA+高糖处理组;(6)SC sh RNA+高糖处理组;(7)Bmal1 sh RNA+正常糖处理组;(8)SC sh RNA+正常糖处理组。通过Western blot检测m TOR通路相关分子p-m TOR2448、m TOR、p-p70S6K、p-70S6K、p-S6、S6、p-4E-BP1、4E-BP1、p-ULK1、ULK1。随后进一步通过应用m TOR通路抑制剂Rap或转染m TOR进一步抑制或上调m TOR通路的表达,分组如下:(1)Bmal1c DNA+m TOR+高糖;(2)Bmal1 c DNA+高糖;(3)p c DNA+m TOR+高糖;(4)p c DNA+高糖;(5)Bmal1 sh RNA+Rap+高糖;(6)Bmal1sh RNA+高糖;(7)SC sh RNA+Rap+高糖;(8)SC sh RNA+高糖。通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12 5、P62分析心肌细胞自噬情况,并进一步通过应用BAF,以ΔLC3-II表示自噬流水平,来更准确的评估两组的自噬活性。结果:1与正常葡萄糖组相比,高糖组的m TOR通路中的p-p70S6K、p-S6和p-4EBP明显升高,表明高糖可激活m TOR通路。此外,与p c DNA组相比,高糖环境下Bmal1基因过表达对m TOR通路中的p-p70S6K、p-S6和p-4EBP有明显抑制作用,Bmal1基因低表达对该通路有明显上调作用,而正常糖条件下,两组无明显差异,表明只有在高糖环境中Bmal1基因方可激活的m TOR通路。2在Bmal1过表达诱导自噬的基础上进一步过表达m TOR后,可明显减轻Bmal1过表达诱导的自噬,在Bmal1低表达下调自噬的基础上进一步使用m TOR的抑制剂Rap可显著逆转Bmal1低表达对自噬的抑制。结论:1高糖条件下新生大鼠Bmal1基因过表达可抑制m TOR通路,Bmal1基因低表达可上调m TOR通路。2 Bmal1基因通过m TOR信号通路调控心肌细胞的自噬活性,Bmal1基因过表达通过下调m TOR通路诱导高糖条件下心肌细胞的自噬,Bmal1基因低表达通过诱导m TOR通路抑制高糖环境下心肌细胞的自噬。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R542.2

【参考文献】