缺血性脑卒中后提高BMSCs移植存活率及其疗效途径与机制探讨

发布时间：2018-05-01 13:28

  本文选题：HIF-1α + 骨髓间充质干细胞　； 参考：《南方医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:干细胞移植一直是诸多脑损伤疾病(包括脑卒中)治疗应用的研究热点,但其移植后的活力及其功能效率低下是干细胞治疗效果不佳的主要原因之一。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha,HIF-1α)是细胞处于低氧环境状态下的一个较敏感分子。HIF-1α可以影响肿瘤细胞的增殖、凋亡,而关于HIF-1α对干细胞特别是骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗脑卒中的疗效影响及机制尚鲜见报道。本课题通过在BMSCs细胞中过表达HIF-1α,研究HIF-1α对BMSCs存活的影响以及是否可以提高BMSCs移植后的活力及其功能效率,探讨影响BMSCs移植治疗脑卒中疗效的相关因素及相应机制。方法:本研究分为体外实验和体内实验。体外实验中,以CD29、CD90、CD105、CD45为主要标志物,通过流式细胞术鉴定BMSCs;用HIF-1α绿色荧光蛋白(HIF-1α-green fluorescent protein,HIF-1α-GFP)慢病毒载体感染 BMSCs,并将 BMSCs 置于氧-糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)条件下(37℃恒温,以体积比50 mL C02/L+ 950 mL N2/L混合气充气30min,用于平衡pH值),无氧无糖培养BMSCs 2h;采用四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测BMSCs细胞存活率、流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况、电镜检测BMSCs细胞自噬的超微结构、Western Blot检测HIF-1α、凋亡和自噬相关蛋白的表达;使用腺苷酸活化蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]的选择性抑制剂即Compound C阻断信号通路,检测HIF-1α过表达是否通过激活AMPK、抑制哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路而起到调控凋亡和自噬的作用。体内实验中,将HIF-1α过表达的BMSCs移植到大脑中动脉闭塞模型(Middle Cerebralartery Occlusion,MCAO)大鼠左侧纹状体内,采用荧光显微镜观察GFP阳性细胞率,氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法检测大鼠颅脑梗死体积,改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS)评估 BMSCs 移植后的大鼠的神经功能,Western Blot检测BMSCs移植后相关细胞因子的变化。结果:体外实验中,流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物的表达结果:其中 CD29(96.72%)、CD90(98.53%)、CD 105(98.99%)阳性表达;CD45(0.53%)阴性表达。qRT-PCR检测结果显示HIF-1α-GFP在BMSCs细胞中稳定转染,与对照组相比,HIF-1α的mRNA和蛋白水平明显升高。MTT、TUNEL和流式结果显示:细胞在OGD条件下BMSCs存活率显着降低,细胞凋亡明显增加,而上调BMSCs细胞中HIF-1α的表达可以显著增强BMSCs的细胞存活率,抑制细胞凋亡。在OGD诱导后凋亡蛋白Caspase-9、Bax的蛋白表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl的蛋白表达下调。在OGD条件下,HIF-1α过表达可抑制Caspase-9和Bax的表达,促进Bcl-2,Bcl-xl的表达。电镜检测显示:在OGD诱导后,在HIF-1α过表达的BMSCs细胞中观察到较多的自噬体和自体溶酶体,并且HIF-1α过表达促进了 LC3-II和Beclin1蛋白的表达,抑制了 P62蛋白的表达。为进一步探索HIF-1α调控BMSCs调控凋亡和自噬的机制,Western Blot检测发现:HIF-1α促进了 OGD处理后细胞AMPK蛋白的磷酸化,并对mTOR磷酸化则产生抑制作用,而AMPK磷酸化抑制剂compound C逆转了 HIF-1α对mTOR磷酸化的抑制作用。体内实验中,相较于正常的BMSCs移植组,HIF-1α过表达的BMSCs移植组GFP阳性率升高,脑梗塞体积缩小更明显,mNSS评分更佳,肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-α)、白介素 1β(interleukin 1β,IL1β)、IL-6炎性因子表达减少,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等营养因子表达升高。结论:过表达HIF-1α可提高BMSCs移植后的细胞活力及其功能效率并提高BMSCs对脑卒中的疗效。HIF-1α通过促进BMSCs的AMPK蛋白磷酸化、抑制其mTOR磷酸化,抑制BMSCs的凋亡、促进BMSCs的自噬,进而使BMSCs存活率及功能效率增加,发挥疗效作用。
[Abstract]:Background: stem cell transplantation has always been a hot spot in the treatment of many brain injury diseases (including stroke), but the vitality and low functional efficiency after transplantation are one of the main reasons for the poor effect of stem cell therapy. The hypoxia inducible factor -1 alpha (Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha, HIF-1 a) is in the condition of hypoxic environment. A more sensitive molecule.HIF-1 alpha can affect the proliferation and apoptosis of tumor cells, and the effect and mechanism of HIF-1 a for stem cells, especially bone marrow mesenchymal stem cells (Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) transplantation in the treatment of stroke, is rarely reported. This lesson is to study HIF-1 alpha by overexpressing HIF-1 a in BMSCs cells. The influence of the survival of BMSCs and whether it can improve the vitality and functional efficiency of BMSCs after transplantation, and discuss the related factors and mechanism affecting the therapeutic effect of BMSCs transplantation in the treatment of stroke. Methods: This study is divided into in vitro and in vivo experiments. In vitro, the main markers of CD29, CD90, CD105, CD45 are identified by flow cytometry. BMSCs, HIF-1 alpha green fluorescent protein (HIF-1 alpha -green fluorescent protein, HIF-1 alpha -GFP) infected BMSCs with lentivirus carrier, and BMSCs was placed under oxygen sugar deprivation (oxygen-glucose deprivation). The survival rate of BMSCs cells was detected by four methazazazoles colorimetric assay (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT), flow cytometry and TUNEL assay were used to detect the apoptosis of cells. The ultrastructure of autophagy in BMSCs cells was detected by electron microscopy, Western Blot detected HIF-1 a, apoptosis and autophagic protein expression, and adenylate activated protein kinase [Adenos. Ine 5'-monophosphate (AMP) -activated protein kinase, a selective inhibitor of AMPK], the Compound C blocking signal pathway, detects whether the overexpression of HIF-1 alpha plays a role in the regulation of apoptosis and autophagy by activating AMPK and inhibiting the mammalian rapamycin target signaling pathway. Alpha overexpressed BMSCs was transplanted into the left striatum of Middle Cerebralartery Occlusion (MCAO) rats. The rate of GFP positive cells was observed by fluorescence microscopy, and the volume of cerebral infarction in rats was detected by three phenyl tetrazoles (triphenyl tetrazolium chloride, TTC), and the evaluation of neural function defect in rats was improved. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the neural function of rats after BMSCs transplantation, and Western Blot detected the changes of related cytokines after BMSCs transplantation. Results: in the experiment, the expression results of BMSCs surface markers were identified by flow cytometry: CD29 (96.72%), CD90 (98.53%), and 105 (98.99%) positive expression; 0 .53%) negative expression.QRT-PCR detection results showed that HIF-1 alpha -GFP was transfected steadily in BMSCs cells. Compared with the control group, the mRNA and protein level of HIF-1 alpha was significantly increased.MTT. TUNEL and flow cytometry showed that the cell viability decreased significantly under OGD conditions, and cell apoptosis increased significantly. Increase the cell survival rate and inhibit apoptosis of BMSCs. After OGD induction, the apoptotic protein Caspase-9, Bax protein expression up-regulated, anti apoptotic protein Bcl-2, Bcl-xl protein expression down regulated. Under OGD conditions, the overexpression of HIF-1 a can inhibit the expression of Caspase-9 and Bax, and promote Bcl-2, Bcl-xl expression. More autophagosomes and autophagosomes were observed in 1 alpha overexpressed BMSCs cells, and the overexpression of HIF-1 a promoted the expression of LC3-II and Beclin1 protein and inhibited the expression of P62 protein. To further explore the mechanism of HIF-1 a to regulate the regulation of apoptosis and autophagy by BMSCs, Western Blot detected that HIF-1 a promoted cell AMPK after OGD treatment. Phosphorylation of protein could inhibit the phosphorylation of mTOR, and AMPK phosphorylation inhibitor compound C reversed the inhibition of HIF-1 alpha to mTOR phosphorylation. In vivo, the GFP positive rate of HIF-1 a over expressed BMSCs transplantation group was higher than that of the normal BMSCs transplantation group. The volume of cerebral infarction narrowed more significantly, the mNSS score was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better. Necrosis factor -a (tumor necrosis factor-A, TNF- a), interleukin 1 beta (interleukin 1 beta, IL1 beta), IL-6 inflammatory factor expression decreased, brain derived neurotrophic factor (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and other nutritional factors increased. Conclusion: overexpression of alpha alpha It can improve the cell viability and functional efficiency of BMSCs after transplantation and improve the therapeutic effect of BMSCs on stroke..HIF-1 alpha can promote the phosphorylation of AMPK protein of BMSCs, inhibit the phosphorylation of mTOR, inhibit the apoptosis of BMSCs and promote the autophagy of BMSCs, and then increase the survival rate and functional efficiency of BMSCs, and play an effective role.

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3

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本文编号：1829569