电荷对抗菌肽与生物膜相互作用的影响

发布时间：2018-05-01 14:14

本文选题：抗菌肽 + 正电荷氨基酸　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文

【摘要】：抗菌肽(AMPs)广泛存在于动物、植物以及各种微生物中,他们在宿主的先天免疫防御系统中起重要作用。大多数抗菌肽整体上带有正电荷(通常为2至9个),由10-50个氨基酸残基组成,并且其序列中含有一定比例的疏水性氨基酸残基(通常≥30%)。抗菌肽在一级结构上各不相同,但二级结构上大多数抗菌肽属于α-螺旋肽或β-折叠肽。抗菌肽与细胞膜接触时可折叠成两亲性构象,其带正电荷的亲水面与细菌细胞膜中带负电荷的磷脂头部基团通过静电相互作用结合,然后,其疏水面通过疏水作用插入脂质双分子层中,破坏细胞膜的屏障功能,最终裂解细胞膜。抗菌肽不仅能够作用于微生物细胞膜,还能够裂解真核细胞的细胞膜,产生细胞毒性,这阻碍了其临床应用。通过不同方法来降低抗菌肽对真核细胞的毒性、提高抗菌肽对细菌的选择性毒性是目前研究的热点之一。此外,抗菌肽还被用于阳离子聚合物介导的转染应用中,它能裂解酸性条件下的溶酶体膜从而增加转染复合物从溶酶体的释放,进而增强阳离子聚合物介导的转染效率,增加多肽在酸性条件下的膜裂解活性是其作为转染增强剂的必要条件。因此我们的研究目的有两个,一方面是通过对天然抗菌肽进行氨基酸残基替换,获得对真核细胞毒性低而对细菌选择性毒性高的多肽,以便于其临床抗细菌感染的应用;另一方面,通过对天然抗菌肽进行氨基酸残基替换来设计在酸性条件下膜裂解活性较强而在中性条件下细胞毒性较低的多肽,用于增强阳离子聚合物的转染效率。一、正电荷氨基酸残基对抗菌肽选择性毒性的影响。我们首先通过对含有不同正电荷氨基酸残基数的RV-23、AR-23和melittin三个天然抗菌肽进行对比研究,探索正电荷氨基酸残基对抗菌肽物理特征及其对细菌和真核细胞膜的结合和裂解能力的影响。我们对比了三个抗菌肽的物理参数,例如螺旋性、疏水性和两亲性,同时检测了三个抗菌肽的抑菌活性和真核细胞毒性。考虑到抗菌肽可能应用于人体,我们还评价了抗菌肽的血液相容性,我们研究了三个抗菌肽对血液关键成分如红细胞和血小板的影响,还通过血栓弹力图评价了抗菌肽对凝血纤溶系统的整体影响。其次,我们以AR-23为模板,用带正电荷的氨基酸残基(Arg或Lys)取代其第1、8、或/和17位上不带电荷的氨基酸残基,设计了一系列AR-23改构肽,用来研究正电荷氨基酸残基的数目和分布对抗菌肽选择性毒性的影响。我们测定了改构肽在水溶液和不同膜模拟环境中的二级结构,评价了改构肽的抑菌活性和抗生物膜活性以及改构肽的溶血活性和对L929细胞的细胞毒性,并初步探索了改构肽破坏细胞膜的机制。结果显示,三个天然抗菌肽均具有良好的抑菌活性,同时,具有较多正电荷氨基酸残基的RV-23对细菌的选择性毒性较高,具有最高的治疗指数,三个抗菌肽均具有典型的α-螺旋结构,其中RV-23的α-螺旋含量最低,这可能与其真核细胞毒性低有关,同时RV-23的疏水性也较低,因为高疏水性和高α-螺旋含量可能与抗菌肽的高溶血活性相关,因此,RV-23对细菌的选择性毒性高可能是由于其疏水性和α-螺旋性均较低。RV-23不仅对细菌的选择性毒性较高,其对血液成分如红细胞、血小板的影响也较小,对凝血纤溶系统的功能基本没有影响。正电荷氨基酸残基的位置对抗菌肽的选择性毒性影响较大,用带正电荷的赖氨酸残基取代AR-23疏水面上第17位异亮氨酸残基能明显改变多肽的疏水性、两亲性、螺旋性以及其溶血活性,然而,在亲水面上用带正电荷的氨基酸残基进行取代,对AR-23的物理性质和生物活性影响较小。在AR-23疏水面上进行取代能够在保持其裂解细菌细胞膜活性的同时减少其对真核细胞膜的粘附和破坏。改构肽A8(第1、8和17位残基均被带正电荷的氨基酸残基取代)对细菌的选择性毒性最高,真核细胞毒性最低,同时A8还具有一定的抗生物膜能力。二、电荷对抗菌肽在酸性条件下膜裂解活性的影响及其增强基因转染效率的作用研究。在这部分实验中,我们通过将melittin和RV-23序列中带正电荷的氨基酸残基全部替换成带负电荷的谷氨酸残基来设计pH敏感肽,用于增强阳离子聚合物基因递送载体的递送效率,通过溶血实验和钙黄绿素释放实验,我们对比了谷氨酸残基替换后的改构肽在中性和酸性pH条件下的膜裂解活性,检测了带负电荷的改构肽对阳离子递送载体聚乙烯亚胺(PEI)/质粒DNA复合物物理特征的影响,同时检测了改构肽对PEI/寡核苷酸(ODN)在细胞内运输的影响,最后我们评价了改构肽增强PEI介导的基因转染效率的能力及其细胞毒性。此外,我们还对AR-23带正电荷的氨基酸残基用谷氨酸残基进行系统地替换,研究抗菌肽谷氨酸残基数对其pH敏感性的影响,同样的我们通过溶血实验和钙黄绿素释放实验检测了多肽净电荷数对其在酸性pH条件下膜裂解活性的影响,还评价了不同谷氨酸残基数的多肽对聚赖氨酸(PLL)介导的基因转染效率和对PLL/寡核苷酸(ODN)在细胞内运输的影响。结果显示,谷氨酸残基替换后的抗菌肽在酸性pH条件下具有较高的α-螺旋率及较高的膜裂解活性,而在中性环境中的膜裂解能力显著降低。谷氨酸残基替换后的改构肽不影响PEI缩合质粒DNA的能力,而对PEI/DNA复合物的粒径和zeta-电位有明显的影响,透视电镜显示掺入改构肽的PEI/DNA复合物聚团、呈不规则的大颗粒。将改构肽掺入PEI/ODN复合物能明显增强FITC-ODN释放进入细胞质,同时能够增强PEI介导的转染效率,而且仅少量增加PEI的细胞毒性。抗菌肽谷氨酸残基数对其pH敏感性的影响较大。对AR-23而言,只有当谷氨酸残基数多于两个时,其在酸性pH条件下的膜裂解活性才较高,只有含3个谷氨酸残基的改构肽增强PLL的转染效率才较明显,其增强PLL转染效率的潜能高于常用的氯喹,并且产生的细胞毒性远低于氯喹。综上所述,一方面通过对天然抗菌肽进行正电荷氨基酸替换,我们获得了对细菌选择性毒性高而对真核细胞毒性较低的合成肽,这有利于抗菌肽的临床应用。另一方面通过用谷氨酸残基替换天然抗菌肽正电荷氨基酸残基,我们获得了在酸性条件下膜裂解活性较高的多肽,这类多肽可作为增强剂用于增强阳离子聚合物的转染效率。本研究为推进抗菌肽的应用奠定了基础。
[Abstract]:In addition , the antibacterial peptide can be used in cationic polymer - mediated transfection applications .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R978

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