丙泊酚对卵巢癌细胞侵袭和紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用中转录因子Slug

发布时间：2016-11-24 08:01

  本文关键词：丙泊酚对卵巢癌细胞侵袭和紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用中转录因子Slug的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2015年

丙泊酚对卵巢癌细胞侵袭和紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用中转录因子Slug的影响

王萍  

【摘要】：背景和目的卵巢癌(OVCA)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤。由于卵巢在盆腔内位置较深,卵巢癌早期又缺乏特异性症状,卵巢癌已是女性死于癌症相关疾病的第五大原因,是几十年困扰临床医生和研究者的难题。这主要是由于缺少疾病的早期检测方法,导致原发肿瘤快速地具有侵略性地细胞腹膜扩散,致使大多数患者的不良预后。获得迁移和侵袭能力是公认的卵巢癌细胞转移的一个必要的先决条件,但导致卵巢癌细胞转移的确切分子机理尚未得到很好的阐明。化疗药物耐药性是肿瘤治疗中一个严峻的问题,因为许多肿瘤对使用的一些细胞毒试剂本质上是耐受的,而其余肿瘤,尽管它们最初是敏感的,在重复使用抗肿瘤试剂后,最终对抗肿瘤试剂产生耐受性。对卵巢癌,在肿瘤的最佳切除手术和标准化疗后,晚期疾病患者增加5年生存率。尽管卵巢癌对化学治疗相对敏感,但临床上化学治疗经常遭遇耐药性。这种获得性耐药性的发展成为成功治疗的主要限制。因此,迫切需要确定肿瘤细胞对化疗药物耐药机制以研制新的药物重新提高肿瘤细胞对主要化疗的灵敏度。近期对食管鳞状细胞癌,膀胱癌,胰腺癌和卵巢癌的研究表明,转录因子Slug是侵袭过程和致癌过程中的重要操纵子。在胆管癌细胞中,Slug沉默能够增强细胞对顺铂和辐射的敏感性。在卵巢癌中,Slug也能调控抗辐射和药物抗性。因此,我们认为Slug可能是一个有效的基因靶。丙泊酚(2,6一二异丙基苯酚),是一种能够产生平稳诱导且能迅速苏醒的最常用的静脉麻醉药,自上世纪八十年代末引进国内,现已广为接受。除了具有多种麻醉优越性,丙泊酚还能发挥一些非麻醉剂的作用。丙泊酚可通过调节Rho A抑制癌细胞的侵袭能力,暗示它可能是癌症手术中完美的麻醉剂。在肺癌细胞中,体外实验证明丙泊酚可阻止MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达,从而抑制侵袭和迁移。在结肠癌细胞中,丙泊酚促进抑制癌细胞的侵袭部分是由于ERK1/2-依赖的金属蛋白酶减量调节。我们最近报道了丙泊酚使NF-κB信号通路失活可以废除吉西他滨诱导的NF-κB活性活化,结果导致了胰腺肿瘤的化疗增敏作用。然而,在胆囊癌中,丙泊酚却通过活化Nrf2诱导增殖和促进入侵。在本研究中,我们用对紫杉醇敏感的和耐药的卵巢癌细胞株在体外检测了丙泊酚对细胞侵袭和诱导细胞凋亡的影响,同时观测slug水平与之相关性。以期探明丙泊酚是否对卵巢癌细胞侵袭具有抑制作用；是否能够促进紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡；转录因子Slug是否是丙泊酚抑制卵巢癌细胞侵袭并促进紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的一个有效的基因靶。材料和方法1.细胞与细胞培养人卵巢癌细胞株HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2。SKOV-3和OVCAR-3细胞培养在DMEM培养基中,加10%热灭活胎牛血清,50μg/mL庆大霉素和1mmol/L丙酮酸钠。HO-8910PM, HO-8910, COC1和ES-2培养在RPMI培养基中,加10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素和1%L-谷氨酰胺。所有的细胞都是在37℃含有5%的CO2的细胞培养箱中。2.药物暴露将对数生长期的细胞接种于96孔板,5×103个细胞/孔。孵育24小时后,用含有一系列浓度紫杉醇(0.01-10μmol/L)或丙泊酚(0.1-10μg/mL)的含5%胎牛血清的MEM培养基替换原培养基,继续培养72小时做剂量依赖分析。时间依赖的测定,5×103个细胞/孔在含10μmol/L紫杉醇或5μg/mL丙泊酚的5%胎牛血清MEM培养基中孵育24-72h。采用MTT法测定剩余活细胞的相对数。TUNEL染色法检测细胞凋亡3.化学敏感性试验细胞接种于96孔板,5×103个细胞/孔。孵育24小时后,培养基替换为含5μg/ml丙泊酚的5%胎牛血清MEM,额外孵育24小时,将细胞暴露于0.1μmol/L的紫杉醇溶液48小时。剩余活细胞的相对数量采用MTT法测定。TUNEL染色法检测凋亡细胞。4.MTT实验5×103个细胞/孔种板,每组设置3个重复孔,按上述方法作用标示时间后,每孔添加10μL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-二苯基溴化物),避光培养4小时。吸出培养基MTT混合物,每孔添加150μL MTT溶剂(0.1 N盐酸无水异丙醇)。室温摇床孵育10分钟,用移液管充分混合直到所有的甲晶体溶解。以690 nm处的吸光度为背景测量570 nm的吸光度变化。从570 nm的吸收值减去690 nm的吸收值以获得最终的吸收值。5. TUNEL实验上述细胞1×104个,在指定的时间移至玻片培养24小时。细胞凋亡根据制造商的说明用TUNEL法评价。所有试验均一式四份。6.细胞侵袭实验侵袭实验,HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2细胞,用0.1-10微克/毫升丙泊酚处理72小时,或5微克/毫升的丙泊酚处理24-72小时。然后2×103个上述细胞在无血清培养基中添加到每个插条的内部。板在5%的二氧化碳中37℃孵育24小时后,将插条中的介质移除,并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗插条。插条膜用冷甲醇固定10分钟,在25%甲醇中用0.5%结晶紫染色10分钟,水冲洗除去多余的染料。将膜从插条内移出,放在显微镜下,清点迁移通过多孔膜的细胞数量。7.蛋白质印迹分析蛋白质印迹分析,用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞二次,并在细胞裂解液中裂解30分钟。样品超声处理30秒,离心力12000×g,4℃离心20 min。样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后在硝酸纤维素膜上电泳印迹。膜被阻挡在含5%牛奶的TBS/吐温-20缓冲液,并和稀释在TBS/吐温-20/BSA(牛血清白蛋白)中的初次抗体在4℃下孵育一夜。随后的要素是抗-slug。所有印迹与结合辣根过氧化物酶(HRP)(2000/1)的二抗一起孵育,使用增强的化学发光法(ECL)培养。采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。8.统计分析统计上的显著差异由配对t检验和单因素方差分析检测,定义P0.05。所有实验均独立地重复至少三次。结果1.卵巢癌(OC)细胞系对紫杉醇耐药性的变化我们体外研究了六个卵巢癌细胞系(HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2)对紫杉醇的相对灵敏度。卵巢癌细胞用不同浓度的紫杉醇处理72小时,存活细胞数用MTT法分析。由此,对HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3细胞,紫杉醇的LD5010微摩尔/升,HO-8910,COC1和ES-2细胞的LD50为0.1微摩尔/升左右。当用TUNEL法分析紫杉醇对细胞凋亡的影响时获得同样敏感性。这些数据支持将HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3细胞株对紫杉醇耐药,HO-8910, COC1和ES-2细胞株对紫杉醇敏感的分类。2.卵巢癌细胞系的slug水平为了检验slug基底水平可以预测紫杉醇的敏感性这一假设,我们最初通过蛋白质印迹试验评估卵巢癌细胞系slug水平。Slug蛋白含量最高的是HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3细胞,slug蛋白水平最低的是 HO-8910, COC1和ES-2细胞。因此,卵巢癌细胞表现出升高的slug,耐药细胞对敏感性细胞株有一致的slug模式,紫杉醇敏感细胞对紫杉醇耐药细胞slug有一致的差异。3.紫杉醇治疗增加敏感细胞中slug的表达但对耐药细胞无作用HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2细胞分别以0.001,0.01,0.1,1,10微摩尔/升紫杉醇处理24小时,用蛋白质印迹法检测slug。用0.001-10微摩尔/升紫杉醇处理24小时对耐药的HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3细胞中slug水平无显者影啊。然而,对紫杉醇敏感的HO-8910, COC1和ES-2细胞,用0.1微摩尔/升的紫杉醇处理24小时slug的水平显著增加。4.丙泊酚治疗可抑制耐药细胞的细胞侵袭但不作用于敏感细胞全身麻醉丙泊酚血浆靶浓度在3至8μg/mL之间。在本研究中,卵巢癌HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2细胞用0.1-10μg/mL丙泊酚处理72小时,或5μg/mL的丙泊酚处理24-72小时。抑制入侵的剂量依赖方式和时间依赖方式-在紫杉醇耐药的卵巢癌HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3细胞,5-10μg/mL丙泊酚的浓度足以抑制癌细胞的侵袭能力。而在紫杉醇敏感细胞HO-8910, COC1和ES-2中丙泊酚的抑制效应不明显。5.丙泊酚治疗可抑制耐药细胞的细胞增殖和促进细胞凋亡但对敏感细胞不起作用HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2细胞经0.1-10μg/mL丙泊酚处理24、48和72小时。丙泊酚降低紫杉醇耐药细胞HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3的增殖,MTT法检测其具有时间依赖和剂量依赖行为。用TUNEL法进行细胞凋亡分析,丙泊酚促进紫杉醇耐药细胞HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3的凋亡。在紫杉醇敏感的HO-8910, COC1和ES-2细胞中无显著效果。6.紫杉醇治疗后丙泊酚对耐药性和敏感性细胞中的slug均能抑制因为5μg/mL丙泊酚处理48小时后能显著抑制卵巢癌细胞侵袭并促进卵巢癌细胞凋亡。因此,我们用5μg/mL丙泊酚处理48小时做进一步的研究。HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3,OVCAR-3, COC1和ES-2细胞经5μg/mL丙泊酚处理48小时。细胞中Slug蛋白显著地或完全地被抑制。虽然0.1μmol/L紫杉醇治疗24小时后显著增加了对紫杉醇敏感的HO-8910, COC1口ES-2细胞的slug水平,5μg/mL丙泊酚预处理则完全抑制0.1μmol/L紫杉醇治疗48小时后Slug蛋白。7.丙泊酚增强紫杉醇对耐药和敏感细胞诱导的细胞凋亡丙泊酚治疗会增加卵巢癌细胞系对紫杉醇促成的细胞凋亡的敏感性,为了检验这一假设,卵巢癌HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2细胞用5μg/mL丙泊酚预处理24小时,然后检测其单独作用及其和0.1μmol/L浓度的紫杉醇的联合作用。丙泊酚联合0.1μmol/L浓度的紫杉醇治疗显著降低细胞数且在体外增加所有卵巢癌细胞的细胞凋亡。结论我们的研究发现,丙泊酚治疗可抑制卵巢癌细胞侵袭和促进卵巢癌细胞凋亡,并促进紫杉醇杀死所有对紫杉醇敏感的和耐药的卵巢癌细胞。观察到基底slug水平和紫杉醇敏感性之间具有显著的相关性。紫杉醇治疗增加slug的水平。结果表明,通过抑制slug,丙泊酚抑制卵巢癌细胞侵袭和转移,提高紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡。这些结果显示,丙泊酚可能是理想的卵巢癌手术麻醉剂且是有用的卵巢癌治疗增敏剂。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614;R737.31
【目录】：

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