Shox2介导HCN4基因修饰犬MSCs定向分化心脏起搏样细胞的实验研究

发布时间：2016-11-25 23:30

  本文关键词：Shox2介导HCN4基因修饰犬MSCs定向分化心脏起搏样细胞的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

《第三军医大学》 2015年

Shox2介导HCN4基因修饰犬MSCs定向分化心脏起搏样细胞的实验研究

冯媛媛  

【摘要】：背景和目的近年来,随着分子生物学、细胞生物学、基因工程学及细胞移植技术的快速发展,心脏“生物起搏”(biologicɑl pɑcemɑker)研究已成为探索治疗缓慢性心律失常新方法的又一热点。而纵观心脏生物起搏研究历程,主要经历了“细胞治疗、基因转移及基因细胞治疗”三个阶段,而“基因细胞治疗”是将起搏基因转染干细胞后再注入心脏,共同增强心脏生物起搏功能。起搏电流(current funny,If)是窦房结细胞舒张期自动除极化的主要决定因素。超极化激活的环化核苷酸门控通道(HCN)基因家族是If形成的分子基础,HCN基因家族有四个成员:HCN1~HCN4,其中HCN4在动物窦房结细胞的比例最高,是If产生及维持基本窦性心律的重要因素。近年来,本课题组对HCN4基因转染骨髓间充质干细胞(Mesenchymɑl stem cells,MSCs)体外诱导分化及重建心脏生物起搏点进行了系列研究,不仅在体外成功诱导出可稳定表达HCN4、且具有自主搏动特性的心脏起搏样细胞;而将HCN4基因修饰的MSCs移植至Ⅲo房室传导阻滞犬心室肌,4周后可记录到起源于移植部位的室性自主节律,但因其频率较慢(59±5次/分),不能满足实验动物生理需要。因而导入新的功能基因,使HCN4基因修饰的MSCs移植后继续保持起搏细胞基因表型及起搏功能,已成为心脏生物起搏研究的新策略。既往研究显示,窦房结发育是一严格的基因调控过程,许多基因参与了该调控网络,包括HCN4、Tbx3、Nkx2.5和Shox2。同源结构域转录因子(homeodomɑin trɑnscription fɑctor)Shox2是近年发现的重要的转录调控因子,只在窦房结区域特异性表达。Shox2的无效突变可导致胚胎死亡,Tbx3和HCN4表达下降。在爪蟾和小鼠胚胎中过表达Shox2能下调Nkx2.5的表达,说明Shox2通过抑制Nkx2.5,在窦房结分化过程中具有重要的作用。但Shox2对HCN4的调控及维持起搏细胞基因表型的作用及机理尚不十分清楚。我们推测Shox2通过抑制Nkx2.5而上调Tbx3与HCN4表达,进而促进HCN4基因修饰的MSCs移植后继续保持起搏细胞基因表型及起搏功能,达到提高新建生物起搏点起搏频率之目的。为验证上述理论假设,本研究拟采用双基因转染技术,将Shox2与HCN4双基因共同转染至犬MSCs,并行脉冲微电流刺激(electric pulse current stimulɑtion,EPCS)模拟体内微电环境,在体外进行诱导分化培养,以获得具有心脏起搏细胞特性的起搏样细胞,为在体心脏生物起搏研究奠定实验基础。研究方法1.参照本实验室前期建立的方法进行犬MSCs分离、培养与鉴定,而后进行MSCs纯化及扩增,倒置显微镜下观察培养细胞的形态学特征。2.慢病毒载体构建:分别构建携带HCN4+GFP、Shox2+RFP基因及仅含RFP的慢病毒载体,获得p Lentis-HCN4-GFP、p Lentis-Shox2-RFP及p Lentis-RFP。病毒载体内携带嘌呤霉素抗药基因可用于细胞纯化。3.将已构建好的慢病毒载体分别转染至第3代生长良好的c MSCs,获得以下四组。①HCN4组:转染p Lentis-HCN4-GFP。②Shox2组:转染p Lentis-Shox2-RFP。③Shox2-HCN4组:共转染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP。④对照组(RFP组):只转染p Lentis-RFP。转染前行预实验确定慢病毒的最佳细胞转染密度、最佳转染体系、共转染的最佳转染体系,必要时可用嘌呤霉素筛选纯化转染阳性的细胞。各组细胞分别进行体外扩增培养。4.对经诱导分化培养后的各组细胞进行检测①细胞形态学检测:光学显微镜下观察各组细胞大小及形态结构特征;透射电镜观察细胞超微结构及细胞间连接特征。②免疫荧光检测各组细胞Shox2、HCN4、Cx43、Cx45、c Tn T蛋白表达。③分别用定量RT-PCR(q RT-PCR)、Western blotting方法检测相关基因m RNA和蛋白表达情况,如:Shox2、Nkx2.5、Tbx3、HCN4、Cx43、Cx45等。④细胞电生理学检测:选择培养至5-7天的细胞,用全细胞膜片钳技术检测各组细胞膜电流If表达情况。5.EPCS诱导经Shox2、HCN4基因修饰的c MSCs分化为心脏起搏样细胞(1)实验分组①基因转染组:又分为HCN4组、Shox2组、Shox2-HCN4组、RFP组(对照组)。②基因转染+EPCS诱导组:又分为HCN4+EPCS组、Shox2+EPCS组、Shox2-HCN4+EPCS组、RFP+EPCS组。(2)体外诱导培养与检测①将基因转染+EPCS诱导组细胞传代到60 mm的培养皿中,铂金丝为电极导丝。②在细胞种植后第二天即开始行EPCS,每天刺激3-6 h,刺激5天直到细胞达到95%增殖,中途换液1次。所有实验均重复3次。③取EPCS刺激第5天的转染+EPCS诱导组细胞,转染组细胞为同一代数培养第5天的细胞进行检测,检测方法与内容同方法4。结果1.犬MSCs的分离、培养采用全细胞贴壁筛选分离法培养c MSCs,原代细胞48 h首次换液后,贴壁细胞呈类圆形、多角形、短梭形,细胞生长缓慢。5~7天后贴壁细胞分裂增殖加快,相邻细胞之间逐渐汇合,可见集落形成,10~14天细胞生长融合可达80%,呈涡旋状或放射状分布排列。传代培养后c MSCs贴壁速度比原代细胞快,呈均匀分布生长。随着细胞换液和传代,贴壁细胞形态逐渐趋于一致;传代至第3代时可得到纯化的呈典型多边形或长梭形的细胞,胞体饱满,折光性好,具有良好的增殖能力。2.慢病毒载体介导Shox2、HCN4双基因转染犬MSCs(1)转染效率的比较①单独转染p Lentis-Shox2-RFP、p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度传代,在次日转染时细胞达到50~60%汇合;慢病毒转染复数MOI=20,联合助转染剂polybrene 2ug/ml,转染时间24 h,该条件下行转染可取得良好的效果。细胞转染后72~96 h,HCN4组细胞可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白GFP的表达;Shox2组细胞可观察到红色荧光蛋白RFP的表达,两组细胞随着培养时间增加,荧光蛋白表达呈增多、增强的趋势。在MOI=20时,HCN4组和Shox2组细胞的转染效率分别为92±3.7%和94±2.5%(n=5),与对照组RFP组细胞的转染效率相当(96±3.5%)。说明此两实验组细胞的转染效率良好。②共转染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度传代,在次日转染时细胞达到50~60%,给予先转染Shox2(MOI=20,polybrene 2ug/ml);24h后弃去废液,重新加入慢病毒HCN4(MOI=27,polybrene 2ug/ml)。结果发现:联合HCN4共转染72 h后,Shox2-HCN4组细胞可在荧光显微镜下观察到红绿两种荧光蛋白混合表达(偏红色、偏绿色、混合橙色),激光共聚焦显微镜下计数Shox2-HCN4共转染细胞的比例为85±2.3%(n=5),共转染效率较高。(2)细胞形态学变化转染慢病毒后,HCN4组、Shox2组和Shox2-HCN4组细胞较对照组细胞生长变慢,其中Shox2-HCN4组细胞生长更慢。三组细胞形状也发生了巨大的变化,显微镜下可见少数细胞呈分叉和长棒形。(3)免疫荧光结果分析免疫荧光结果显示,HCN4组细胞可见HCN4蛋白表达;Shox2组和Shox2-HCN4组细胞除能表达Shox2蛋白外,还可见HCN4及心肌特异性标志物c Tn T表达,其中以Shox2-HCN4组表达更显著。(4)分子生物学检测选择培养5-7天的各组细胞,PCR和Western blotting结果显示:①HCN4、Tbx3和Cx45:与仅转染RFP的对照组比较,Shox2组中HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表达均增加;Shox2-HCN4组Tbx3和Cx45增加较Shox2组更显著;HCN4组中可见Cx45的表达。②Nkx2.5及Cx43:与仅转染RFP的对照组比较,Shox2组Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表达均下降;Shox2-HCN4组Nkx2.5、Cx43 m RNA和蛋白表达下降更为显著;HCN4组细胞中可见Cx43的表达。(5)全细胞膜片钳检测①Shox2组:32%(6/19)的细胞可记录到超极化激活的内向电流,该电流具有明显的时间及电压依赖特性,且对细胞外Cs+敏感,证实其为If电流。根据记录到的尾电流重建该内向电流曲线和翻转电位,并进行Boltzmɑnn拟合和计算,结果显示:Shox2组细胞在-160 m V的电流幅值为-1062.3±18.6 p A,电流密度为-44.3±5.4 p A/p F,半数最大激活电压为-94.3±6.3 m V,斜率为-16.8±1.6,翻转电位是-27.4±3.8 m V。②HCN4组:76%(16/21)的细胞可记录到If电流,其-160m V的电流幅值为-1081.5±15.4 p A,电流密度为-45.6±7.7 p A/p F,半数最大激活电压为-101.2±4.6 m V,斜率为-16.0±1.6,翻转电位是-26.4±3.8 m V。③Shox2-HCN4组:80%(12/15)的细胞能记录到If电流,其-160 m V的电流幅值为-2015.1±17.1 p A,电流密度为-67.6±6.7 p A/p F,半数最大激活电压为-100.3±4.0m V,斜率为-22.2±2.1,翻转电位是-27.5±3.1 m V。3.经EPCS诱导后各组细胞形态及功能变化(1)细胞形态学变化HCN4组、Shox2组和Shox2-HCN4组细胞给予EPCS诱导后,细胞体积变大,呈纺锤样和蜘蛛样改变。细胞增殖最终变缓慢。免疫荧光结果显示:EPCS诱导后,Shox2组和Shox2-HCN4组细胞HCN4和c Tn T的表达更加显著。(2)分子生物学检测取EPCS刺激第5天的转染+EPCS诱导组细胞,单纯转染组细胞为同一代数培养第5天的细胞进行检测。PCR和Western blotting结果显示:①HCN4、Tbx3和Cx45:经EPCS诱导后,Shox2组HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表达增加较诱导前更显著(p0.05);Shox2-HCN4组中Tbx3和Cx45增加较诱导前更显著(p0.05);HCN4组Cx45表达较诱导前明显增加(p0.05)。②Nkx2.5及Cx43:经EPCS诱导后,Shox2组Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表达均较诱导前明显下降(p0.05);Shox2-HCN4组Nkx2.5及Cx43表达量下降较诱导前更加显著(p0.05);HCN4组Cx43表达较诱导前明显增加(p0.05)。(3)全细胞膜片钳检测①Shox2+EPCS组:73%(16/22)的细胞可记录到If电流,-160m V的电流幅值为-1350.1±16.5 p A(p0.05),电流密度为-51.9±8.3 p A/p F(p0.05),半数最大激活电压为-91.2±5.1 m V(p0.05),斜率为-17.5±1.8,翻转电位是-29.5±4.2 m V。②HCN4+EPCS组:77%(17/22)的细胞可记录到If电流,-160m V的电流幅值为-1343.4±18.6 p A(p0.05),电流密度为-53.7±4.0 p A/p F(p0.05),半数最大激活电压为-92.4±4.8 m V(p0.05),斜率为-18.8±1.8(p0.05),翻转电位是-28.9±3.0 m V(p0.05)。③Shox2-HCN4+EPCS组:73%(11/15)的细胞能记录到If电流,-160m V的电流幅值为-2380.5±64.8 p A(p0.05),电流密度为-78.5±11.5 p A/p F(p0.05),半数最大激活电压为-94.1±4.0 m V(p0.05),斜率为-21.4±1.9,翻转电位是-31.3±3.9 m V。结论1.应用慢病毒载体p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP成功将Shox2-HCN4双基因共同转染入c MSCs。2.c MSCs转染Shox2后,能够促进c MSCs向心脏起搏样细胞分化。可观察到心肌特异性标志物c Tn T,在基因和蛋白水平表达起搏细胞标志物HCN4,Tbx3和Cx45,而抑制心肌工作细胞标志物Nkx2.5及Cx43的表达,并能产生功能性If起搏电流,具有心脏发育早期的起搏样细胞特点。3.EPCS作为诱导干预手段能够促进转染Shox2的c MSCs向起搏样细胞分化,使If表达增多,电流特征良性改变,具有心脏起搏样细胞的电生理特点。4.Shox2-HCN4双基因共转染+EPCS诱导,有促进c MSCs向起搏样细胞方向分化的叠加效应。

【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.7
【目录】：

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5 孙大林;养精胶囊提取液对Leydig细胞睾酮合成的影响及机制研究[D];南京中医药大学;2012年

6 徐玲玲;稳恒磁场与抗肿瘤药物联合作用对肿瘤细胞杀伤效应的研究[D];陕西师范大学;2008年

7 刘晓晖;温度和铜对鲤鱼肝脏细胞超微结构的影响[D];东北师范大学;2006年

8 郑末;工频均匀强磁场对体外培养SNU细胞影响的研究[D];河北医科大学;2004年

9 丁雅明;中晚期小鼠胚胎与恶性肿瘤细胞H_（22）相互作用的研究[D];重庆医科大学;2008年

10 何海滨;番荔枝内酯单体Desacetyluvaricin对乙肝相关肝癌细胞TLR4、P53蛋白表达的影响[D];暨南大学;2008年

  本文关键词：Shox2介导HCN4基因修饰犬MSCs定向分化心脏起搏样细胞的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：193115