白藜芦醇对肥胖哮喘大鼠模型的氧化应激抑制作用及其机制研究

发布时间：2018-06-08 03:38

本文选题：肥胖 + 哮喘　；参考：《大连医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:近年来在全球范围内,无论成人还是儿童,肥胖及支气管哮喘两大疾病的发病率均迅速上升。肥胖引发的血脂血糖代谢异常增加了患者糖尿病、心血管疾病的患病风险,且对于儿童患者目前并无安全的降脂药物应用于临床。支气管哮喘是一种气道变态反应性炎症,哮喘急性发作严重影响患者生活质量,重者可致死。流行病学显示,肥胖与哮喘存在一定联系,肥胖增加了哮喘的患病率和发病率,肥胖人群比非肥胖人群更容易出现喘息症状且症状更重;肥胖伴哮喘患者对治疗哮喘常规药物如糖皮质激素和胆碱能药物的反应性通常较差,症状不易控制。但是也有研究认为肥胖并不会引起气道高反应性。故目前肥胖与哮喘的相关性并不十分确切,并且这种关联的机制仍不清楚。因此探索此两种疾病是否有共同的发病机制,并找到合适的药物进行干预,使得降低患者肥胖并发症的同时给肥胖哮喘患者的治疗提供思路是本研究的目的所在。氧化应激是指有害刺激导致体内高活性分子如活性氮族(Reactive Nitrogen Species,RNS)和活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)产生过多,氧化程度超出机体清除能力,从而导致组织损伤。氧化应激所产生的活性分子通过不同途径损伤细胞蛋白、核酸等的生理功能,是许多疾病发生的病理生理基础。近年来,在肥胖与其相关疾病如糖尿病、心血管疾病的研究中发现患者体内的氧化应激标志物水平较正常人群升高。哮喘发生过程中许多系统和物质被激活,进而发生炎症反应失调,哮喘发病机制中存在肥胖引起氧化应激的相同炎症因子,故推测氧化应激可能为肥胖并哮喘的共同且重要的发病机制。Keap1-Nrf2信号通路在机体抵抗氧化应激的机制中具有重要地位,是细胞防御系统的重要成员,该通路在包括哮喘在内的多种呼吸道疾病中处于活化状态。在无应激的状态下,Nrf2与其负调控因子Keap1相互作用并形成Nrf2/Keap1复合物,Nrf2通过该复合蛋白的降解而泛化降解。在应激的状态下,P-Nrf2/Keap1复合物便转移至细胞核并与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相结合,从而激活多种抗氧化基因。Keap1-Nrf2通路在机体抗炎,抗氧化应激等生物过程中发挥着重要的作用。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是虎杖、葡萄、决明子和花生等天然植物中的一种有效成分,是具有二苯乙烯类结构的非黄酮类多酚化合物。白藜芦醇具有毒性低、作用广的优势,因此成为国内外诸多研究领域的热点。近年研究显示白藜芦醇具有抗氧化、调节免疫等作用。白藜芦醇能与脂蛋白结合,而增强后者的抗氧化性,减少低密度脂蛋白的氧化和胆固醇在动脉中的沉积,从而可以降低高脂血症以及动脉粥样硬化发生的风险。同时也有研究证实白藜芦醇对肺部疾病如肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压、急性肺损伤等均有一定的治疗效果。白藜芦醇对胖哮喘肥大鼠模型氧化应激的干预研究目前尚无报道,因此本实验选用白藜芦醇干预实验动物,旨在明确白藜芦醇对高脂膳食肥胖哮喘大鼠氧化应激的抑制作用,并进一步探索白藜芦醇是否通过对Keap1/Nrf2通路的作用抑制氧化应激,为肥胖哮喘的发病机制研究以及肥胖哮喘今后的药物治疗提供实验参考。目的:1.通过对比3T3-L1脂肪细胞及不同浓度白藜芦醇培养后的脂肪细胞氧化应激反应中活性氧及抗氧化应激因子的含量,在细胞水平探讨白藜芦醇对肥胖性哮喘氧化应激反应的抑制作用。2.建立大鼠高脂膳食肥胖、哮喘及肥胖哮喘动物模型,明确白藜芦醇对糖脂代谢的影响;为肥胖哮喘动物模型的建立提供依据3.检测肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型体内氧化应激反应情况,探讨Keap1-Nrf2通路在肥胖哮喘大鼠模型发病机制中的重要作用。4.给予抗氧化剂白藜芦醇干预肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型,探讨白藜芦醇对于机体内细胞氧化应激的抑制作用,进一步探索白藜芦醇是否通过Keap1-Nrf2通路对肥胖性哮喘氧化应激反应发挥的抑制作用。方法:1.细胞实验:(1)3T3-L1前脂肪细胞培养;(2)用成脂诱导完全培养基诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞,油红O鉴定成脂诱导效果;(3)白藜芦醇(10μmol/L)、白藜芦醇(50μmol/L)分别干预3T3-L1脂肪细胞后,对对照组脂肪细胞和不同浓度白藜芦醇干预细胞进行形态学观察、流式细胞术检测各组细胞内活性氧水平、比色法测定还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、过氧化氢酶(H_2O_2)活性和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;(4)real-time PCR测定对照组细胞和不同浓度白藜芦醇干预组脂肪细胞Keap1和Nrf2的m RNA表达。2.建立大鼠模型:(1)通过高脂饮食诱导建立肥胖大鼠模型;(2)通过经典的慢性哮喘大鼠气道重塑模型的诱导,即OVA(鸡卵清蛋白)致敏和激发,建立哮喘大鼠模型;(3)OVA(鸡卵清蛋白)致敏和激发肥胖大鼠,建立肥胖哮喘大鼠模型;(4)通过血清生化及ELISA法检测肥胖、哮喘、肥胖哮喘组大鼠的血糖、血脂指标;(5)石蜡切片HE染色法观察各组大鼠的心、肺、肾脏脂肪细胞形态及支气管和肺泡病理学改变。3.大鼠模型体内实验:(1)将大鼠分为七组:正常组、肥胖组、哮喘组、肥胖哮喘组、0.03%RSV干预肥胖组、0.03%RSV干预哮喘组和0.03%RSV干预肥胖哮喘组;(2)流式细胞术检测各组细胞内活性氧水平;(3)比色法测定各组大鼠心、肺和肾脏组织内还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、过氧化氢酶(H_2O_2)活性和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;(4)real-time PCR测定大鼠心、肺和肾脏组织内Keap1和Nrf2的m RNA表达;(5)Western Blot测定大鼠心、肺和肾脏组织内Keap1和Nrf2的蛋白质表达。结果:1.白藜芦醇对脂肪细胞氧化应激的抑制作用:(1)3T3-L1脂肪细胞培养及诱导分化:油红染色结果胞浆内含有大量的淡红色脂滴,提示3T3-L1脂肪细胞诱导分化成功;(2)10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干预的3T3-L1脂肪细胞组ROS水平较对照组显著降低(P0.05);(3)10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干预的3T3-L1脂肪细胞内GSH含量、GSH-Px酶、H_2O_2酶和SOD酶活性明显增高,与对照组相比具有显著性差异(P0.01),且高浓度RSV干预组上述抗氧化应激因子和酶活性增高更明显;(4)10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干预的3T3-L1脂肪细胞组Keap1 m RNA表达水平明显低于对照组(P0.05),而Nrf2基因的m RNA表达水平明显升高,与对照组相比具有显著性差异(P0.05)。2.肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型的建立、分组及相关指标的检测:(1)成功建立肥胖、哮喘和肥胖哮喘大鼠模型;(2)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组血糖水平显著高于正常对照组(7.7mmol/L,8.1mmol/L,8.5mmol/L.vs.4.6mmol/L,P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组血糖水平明显降低,与肥胖、哮喘、肥胖哮喘组相比具有显著性差异(P0.05);(3)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组高密度脂蛋白胆固醇水平显著低于正常对照组(0.451mmol/L,0.452mmol/L,0.28mmol/L.vs.0.895mmol/L,P0.01),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组高密度脂蛋白胆固醇水平明显升高,分别与肥胖、哮喘、肥胖哮喘组相比具有显著性差异(P0.05),肥胖、哮喘、肥胖哮喘组甘油三酯、总胆固醇、极低密度脂蛋白水平显著高于正常对照组(P0.01),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组甘油三酯、总胆固醇、极低密度脂蛋白水平明显降低,与肥胖、哮喘、肥胖哮喘组相比具有显著性差异(P0.05);(4)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组脂肪细胞肥大,组织细胞数量减少,细胞间距增大,各细胞之间排列不紧密,其间散在炎症细胞分布,肥胖哮喘组改变更为显著,0.03%RSV干预后肥胖组、哮喘组和肥胖哮喘组细胞肥大减轻、组织细胞数量明显增加;(5)哮喘组及肥胖哮喘组大鼠气道黏膜水肿明显,上皮不完整,管腔内充满炎性分泌物,管腔狭窄甚至闭塞,平滑肌及基底膜明显增厚,白藜芦醇干预后上述病理变化均有不同程度的减轻。3.白藜芦醇对大鼠体内氧化应激的抑制作用:(1)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内活性氧水平显著高于正常对照组(P0.05),其中肥胖哮喘组的心、肺、肾组织活性氧水平最高;0.03%RSV干预后哮喘组、肥胖组、肥胖哮喘组活性氧水平明显降低,与未接受0.03%RSV干预的肥胖、哮喘、肥胖哮喘组相比具有显著性差异(P0.05),其中哮喘组、肥胖组活性氧水平降低幅度相似,而肥胖哮喘组活性氧水平降低幅度最大,上述结果表明白藜芦醇的对于肥胖及哮喘的活性氧水平具有明显抑制作用;(2)同组大鼠的心、肺、肾组织细胞内GSH、GSH-Px、H_2O_2、SOD酶活性水平基本一致,肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内GSH、GSH-Px、H_2O_2、SOD酶活性等抗氧化应激相关酶活性显著低于正常对照组(P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组抗氧化应激相关酶活性较未干预组大鼠明显升高,并具有显著性差异(P0.05),其中哮喘组、肥胖组抗氧化应激相关酶活性升高幅度相似,而肥胖哮喘组抗氧化应激相关酶活性升高幅度较前两组小,这表明白藜芦醇的对于肥胖及哮喘氧化应激反应中相关抗氧化酶的活性具有促进作用;(3)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内Keap-1 m RNA表达水平明显高于对照组(P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内Keap-1 m RNA表达水平明显低于肥胖、哮喘、肥胖哮喘组,具有显著性差异(P0.05),肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内Nrf2 m RNA表达水平明显低于对照组(P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组心、肺、肾脏组织细胞内Nrf2 m RNA表达水平明显升高,与肥胖、哮喘、肥胖哮喘组相比具有显著性差异(P0.05),这表明在m RNA水平,白藜芦醇的对于肥胖及哮喘大鼠细胞Keap-1/Nrf2信号通路具有的激活作用,同时说明白藜芦醇可通过激活Keap-1/Nrf2信号通路抑制细胞氧化应激的水平;(4)肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心脏、肺、肾脏组织细胞内KEAP-1蛋白表达水平明显高于正常对照组(P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组心脏、肺、肾脏组织细胞内KEAP-1蛋白表达水平明显低于肥胖、哮喘、肥胖哮喘组,并具有显著性差异(P0.05),肥胖、哮喘、肥胖哮喘组心脏、肺、肾脏组织细胞内Nr F2蛋白表达水平明显低于正常对照组(P0.05),0.03%RSV哮喘组,0.03%RSV肥胖组,0.03%RSV肥胖哮喘组心脏、肺、肾脏组织细胞内Nr F2蛋白表达水平较肥胖、哮喘、肥胖哮喘组明显升高,具有显著性差异(P0.05),这些现象表明在蛋白水平,白藜芦醇的对于肥胖及哮喘大鼠细胞Keap-1/Nrf2信号通路蛋白表达具有激活作用,同时证明白藜芦醇可通过激活Keap-1/Nrf2信号通路抑制细胞内氧化应激的水平。结论:1.本研究成功建立大鼠高脂膳食肥胖哮喘动物模型;2.明确了氧化应激在肥胖和哮喘的发生及发展中起着重要作用,肥胖和哮喘可以通过协同或叠加效应,降低大鼠体内抗氧化因子的量和抗氧化酶类的活性来增加肥胖哮喘大鼠体内活性氧水平;3.证实了Keap1/Nrf2信号通路在肥胖哮喘的氧化应激反应中具有重要作用;4.发现白藜芦醇可以通过激活Keap1/Nrf2信号调节通路,实现增加抗氧化分子GSH释放,提高GSH-Px酶、H_2O_2酶及SOD酶等抗氧化酶类的活性,从而在大鼠体内降低了肥胖和哮喘导致的炎症反应中活性氧水平。上述研究结果为肥胖及肥胖哮喘的诊疗提供了新的思路。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R589.2;R562.25

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