塞来昔布在胃癌NCI-N87细胞中的作用和机制研究

发布时间：2018-06-13 14:40

本文选题：胃癌 + 塞来昔布　；参考：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景:胃癌是一种起源于胃粘膜的恶性肿瘤,具有高度的侵袭性和攻击性。除手术切除外,目前常用治疗胃癌的方法是化疗,化疗药物分为细胞毒性化疗药物和非细胞毒性化疗药物。非细胞毒性药物对胃癌有一定的的疗效,且能明显降低药物引起的副作用。非甾体抗炎类药物如环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂属于非细胞毒性化疗药物,在治疗多种肿瘤上有所突破。塞来昔布作为高选择性的COX-2抑制剂可以通过多种途径来抑制肿瘤细胞增殖和血管生长,以及促进调亡,然而塞来昔布对抑制胃癌发生和发展的分子机制尚不清楚。研究目的:1、检测塞来昔布对胃癌NCI-N87细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。2、检测塞来昔布对NCI-N87细胞中COX-2的表达水平的影响。3、通过对塞来昔布处理前后的NCI-N87细胞基因组进行二代测序,筛选塞来昔布处理的NCI-N87细胞中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)和lnc RNAs,预测DEGs潜在的功能和相互作用关系,并分析DEGs和lnc RNAs的共表达情况,挖掘出塞来昔布引起的胃癌NCI-N87细胞中和癌症相关的一些重要DEGs和lnc RNAs,以揭示了塞来昔布治疗胃癌的分子机制。4、检测塞来昔布对NCI-N87细胞中DEGs和lnc RNAs的表达水平的影响,以验证以上生信分析所得结果的可靠性,为临床上用塞来昔布治疗胃癌提供理论和实验依据。研究方法:1、利用MTT法检测塞来昔布对胃癌NCI-N87细胞的增殖能力的影响,利用流式细胞术检测塞来昔布对胃癌NCI-N87细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。2、利用Real-time PCR检测塞来昔布对NCI-N87细胞中COX-2的表达水平的影响。3、构建塞来昔布处理前后的NCI-N87细胞的RNA文库并进行转录组测序(RNA-seq),利用NGSQC Toolkit软件对数据进行预处理,利用cuffdiff软件筛选塞来昔布处理组和空白对照组之间的DEGs和lnc RNAs(q0.05),分别利用Bioconductor中的GO-function包和KEGGprofile对DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(p0.05,且至少两个基因在通路中富集),并分别利用STRING数据库和cytoscape软件筛选DEGs对应的蛋白质相互作用关系对和构建蛋白-蛋白互作网络,此外,计算DEGs和lnc RNAs间的皮尔森相关系数,筛选共表达的lnc RNA与DEGs关系对(相关系数绝对值大于0.98)。4、选取塞来昔布处理后的NCI-N87细胞中差异表达显著,并且参与重要功能和网络的基因作为实验验证对象,利用Real-time PCR检测塞来昔布对NCI-N87细胞中DEGs和lnc RNAs的表达水平的影响。结果:1、塞来昔布对胃癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响MTT分析结果表明,与未经处理的细胞相比,经过塞来昔布治疗的人类胃癌细胞NCI-N87的细胞活性被显著抑制了(p0.05)。流式细胞分析结果表明,与对照组相比,经过塞来昔布治疗的NCI-N87细胞处于G0/G1期的细胞比例显著增高(p0.05),而处于G2期的细胞比例显著降低(p0.05)。流式细胞分析结果表明,与未经处理的细胞相比,经过塞来昔布治疗的人类胃癌细胞NCI-N87的细胞在早期和晚期凋亡均显著增加(p0.05)。2、塞来昔布对胃癌细胞NCI-N87中的COX-2表达水平的影响经过有效剂量(抑制增殖、凋亡增加)的塞来昔布处理的NCI-N87细胞与未经处理的细胞中的COX-2表达量没有显著差异(p0.05)。3、塞来昔布处理前后胃癌细胞中DEGs和差异lnc RNAs的筛选通过对RNA-seq数据进行分析,在塞来昔布处理的NCI-N87样本中共筛选了409个DEGs(包括302个上调基因和188个下调基因)和37个差异表达lnc RNAs(包括19个上调的lnc RNAs和18个下调的lnc RNAs)。4、差异基因功能富集GO功能富集结果表明,上调基因主要富集在小分子代谢过程(ABCC3,ACAA1,B3GNT3和CD320),胞外区(ITGA3,ITGA6,ITGB4和ITGB5)和蛋白结合(AATK,HSP90AA1,ITGA3,ITGA6,ITGB4和ITGB5)等功能上。下调基因主要富集在组织发育(ADAM9,ALDH1A3和FNDC3B),胞外区(ADAM9,CCDC80和CLIC5),和趋化因子的活动(ADAM9,HSPB1,MARCK和PKP2)等功能上。5、差异基因通路富集KEGG通路富集分析发现,上调基因在代谢通路(ATP5G1,ATP5G3,ATP6AP1,COX8A,CYC1,NDUFS3,UQCRC1,UQCRC2和UQCRFS1),氧化磷酸化(ATP5G1,ATP5G3,ATP6AP1,COX8A,CYC1,NDUFS3,UQCRC1,UQCRC2和UQCRFS1)等通路中均出现富集。下调基因在幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号(CXCL1,CXCL8和MAP3K14),趋化因子信号通路(BCAR1,CXCL1,CXCL3,CXCL5和CXCL8)和细胞因子-细胞因子相互作用(BMPR2,CXCL1,CXCL3,CXCL5,CXCL8和TNFRSF19)等通路中出现富集。6、蛋白质网络构建在构建了差异表达基因的蛋白相互作用网络之后,我们进行了子模块分析,并得到两个最显著的模块(模块1和模块2)。模块1中的差异基因(例如ITGB6,LAMA3,ITGA6,ITGB4,ITGB5,ITGA3和ITGB8)主要在整合素介导的信号通路,细胞外基质组建和细胞粘附等功能中出现富集,模块2中的基因(包括CYC1,COX8A,UQCRC1,NDUFS3,UQCRC2和UQCRFS1)在呼吸电子传递链和线粒体内膜等功能中出现富集。模块1中的差异基因(例如LAMA3,ITGA3,ITGA6,ITGB4,ITGB5,ITGB6和ITGB8)主要富集在黏着斑通路和ECM受体交互途径通路中。同时,三个上调基因(LAMA3,ITGA6和ITGA3)在癌症相关通路中出现富集。模块2中的七个上调基因(ATP5G3,CYC1,COX8A,UQCRC1,NDUFS3,UQCRC2和UQCRFS1)在氧化磷酸化和代谢途径等通路中出现富集。7、lnc RNAs与基因共表达Lnc-SCD-1:13,lnc-LRR1-1:2,lnc-PTMS-1:3,lnc-S100P-3:1,lnc-AP000974.1-1:1和lnc-RAB3IL1-2:1这6个lnc RNAs转录本在基底细胞癌(FZD7、WNT7B和DVL1),癌症相关通路(FZD7,DVL1和ITGA3)和ECM受体相互作用(ITGA3)等与癌症相关的通路中均出现共表达基因的富集。Lnc-SCD-1:13和lnc-LRR1-1:2和的共表达基因(DVL1,NFAT5,WNT11和WNT7B)富集到了Wnt信号途径中。Lnc-SCD-1:13,lnc-LRR1-1:2,lnc-PTMS-1:3,lnc-S100P-3:1和lnc-AP000974.1-1:1的共表达基因(BMP4,WNT11和WNT7B)富集到了刺猬信号通路中。8、塞来昔布对胃癌细胞NCI-N87中的DVL1、ITGA3、lnc-SCD-1:13和lnc-PTMS-1:3表达水平的影响利用RT-PCR实验检测塞来昔布处理的胃癌细胞中DVL1、ITGA3、lnc-SCD-1:13和lnc-PTMS-1:3的表达水平。结果表明,与未经处理的细胞相比,这些lnc-RNAs和基因的m RNA水平在经过塞来昔布治疗的NCI-N87细胞中显著增加(p0.05)。结论:1.低浓度的塞来昔布可以不通过COX-2依赖机制来调节胃癌细胞周期和细胞凋亡。2.塞来昔布可以下调CXCL1,CXCL3,CXCL5和CXCL8,可能通过干扰趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子相互作用来抑制胃癌细胞。3.塞来昔布能降低WNT7B表达,可能通过减弱Wnt信号通路的激活来抑制胃癌细胞。4.ATP5G1,ATP5G3,COX8A,CYC1,NDUFS3,UQCRC1,UQCRC2和UQCRFS1等基因可能通过氧化磷酸化通路参与了塞来昔布治疗胃癌的过程。5.Lnc-SCD-1:13,lnc-LRR1-1:2,lnc-PTMS-1:3,lnc-S100P-3:1,lnc-AP000974.1-1:1和lnc-RAB3IL1-2:1通过多种通路参与到了塞来昔布治疗胃癌的过程。6.Lnc-SCD-1:13和lnc-PTMS-1:3的共表达基因ITGA3可能通过整合素介导的信号通路在塞来昔布治疗胃癌的过程中发挥重要的作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of Cxitin on the proliferation , cell cycle and apoptosis of gastric cancer NCI - N87 cells . The expression levels of DEGs and lnc RNAs in human gastric cancer cell line NCI - N87 were significantly increased compared with untreated cells ( p < 0.05 ) . It was found that the up - regulated genes were enriched in the pathway such as the metabolic pathway ( ATP5G1 , ATP5G3 , ATP6AP1 , COX8A , CYC1 , NDUFS3 , UQCRC1 , CYC1 , NDUFS3 , CXCL5 , CXCL8 and TNFRSF19 ) . 7 , lnc RNAs and genes coexpressed Lnc - SCD - 1 : 13 , lnc - LRR1 - 1 : 2 , lnc - AP000974.1 -1 : 2 , lnc - AP000974.1 -1 : 2 , lnc - AP000974.1 -1 : 1 , lnc - AP000974.1 -1 : 2 , lnc - AP000974.1 -1 : 1 and lnc - RAB3IL - 2 : 1 . The expression levels of DVL1 , ITGA3 , lnc - SCD - 1 : 13 , and lnc - PTMS - 1 : 3 in gastric cancer cells treated with exc - Lnc - SCD - 1 : 13 , lnc - PTMS - 1 : 3 , lnc - SCD - 1 : 13 and lnc - AP000974.1 -1 : 1 were detected by RT - PCR . 13 and lnc - PTMS - 1 : 3 co - expression gene ITGA3 may play an important role in the treatment of gastric cancer by integrin - mediated signaling pathways .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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