骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑出血及调控自噬流和轴突再生的机制研究

发布时间：2018-06-13 17:11

本文选题：骨髓间充质干细胞 + 脑出血　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：脑出血(intracerebral hematoma,ICH)作为神经外科最常见的疾病之一,是现代社会严重威胁人类健康的杀手。虽然神经外科血肿清除手术可以作为挽救ICH患者生命的一项主要的治疗措施,但是患者术后仍然会保留严重的神经功能障碍,让其最终难以回归社会。ICH后受损脑组织内皮质脊髓束的修复和重塑是促进患者肢体运动障碍恢复的解剖病理学基础,而轴突的断裂和损伤会直接影响皮质脊髓束的功能。虽然受损死亡后的神经元几乎不能再生,但是神经元轴突却可以表现出一定的再生能力。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是从骨髓中分离出的一种中胚层来源的多潜能干细胞,其具备体外扩增的能力,不仅能够分化成为中胚层起源的脂肪、骨和软骨等组织,而且亦可以分化为内外胚层来源的血管内皮及神经等组织。BMSCs具有较好的增殖能力,易于分离培养,自体移植无免疫源性,不受伦理学限制,越来越多的被应用于急性脑损伤相关疾病治疗相关的实验中。目前体外模型和动物实验中已有BMSCs移植能够促进轴突再生的报道。自噬是指通过对蛋白质聚集体及受损细胞器的降解以维持内环境稳定细胞代谢过程,目前已证实了ICH能够导致自噬的激活。近期有研究发现皮质神经元自噬水平的增强促进了轴突的再生,减少了轴缩球的形成。在全面检索文献和前期工作基础上,我们推测BMSCs移植能够有效改善ICH大鼠的神经功能障碍,促进轴突再生,机制可能与PI3K-Akt-m TOR通路介导的自噬流增强有关。为证明此假说,本课题将分以下三部分进行详细阐述。第一部分骨髓间充质干细胞移植对脑出血大鼠的神经保护作用目的:证实大鼠ICH后BMSCs移植能够发挥神经保护作用,改善神经功能障碍。方法:将98只成年雌性SD大鼠随机分为三组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group)。分离和培养3周龄雄性SD大鼠BMSCs至第三代,流式细胞仪对BMSCs表面标记物进行鉴定。采用注血法复制SD雌性大鼠ICH模型,将2μL浓度为1×108/m L的BMSCs悬液于造模后1小时经脑室注入,检测如下指标:1)HE染色观察术后3天不同组别受损脑组织的病理变化和细胞存活状态;2)免疫荧光检测造模手术前及术后12小时-7天Sry阳性细胞在血肿周围受损脑组织内的分布;3)TUNEL染色显示术后1-7天不同组别受损脑组织细胞凋亡;4)脑组织含水量测定显示1-7天受损脑组织水肿情况;5)于造模手术前及术后12小时-7天进行前置放置实验、转角实验和NSS评分,检测大鼠神经功能障碍的变化。应用Image Lab5.1及Image J等分析系统对实验结果进行测定分析。实验结果写成均数±标准差的形式,用统计软件SPSS 17.0分析,P0.05则差异具有统计意义。结果:1 BMSCs形态学观察:接种后一天,原代BMSCs慢慢贴壁。BMSCs核居中,胞体较小,形状为均和的圆形或者梭形,折光性比较强,增殖方式为散在的克隆增殖。待生长抑制期度过后,细胞平行排列呈现快速的漩涡状聚集生长。之后细胞形态随着传代变的更加均匀,形状多为梭形;2流式细胞仪对BMSCs表面标记物的鉴定结果:我们将第三代BMSCs进行表面标记物的鉴定,流式细胞仪结果显示BMSCs的CD106阳性表达率为74.56%,CD29阳性表达率为76.11%,CD106和CD29呈阳性表达。CD54阳性表达率为5.05%,CD45阳性表达率为3.88%,CD54和CD45呈阴性表达;3大鼠ICH模型的制备情况:大体观察ICH大鼠脑组织可见造模手术的注射点,位于尾状核正上方。选择注射点所在平面横切大鼠脑组织,能够观察到血肿位于基底节区,周围有局部脑组织损伤,脑室内出血及蛛网膜下腔出血亦可见。HE染色显示Sham组大鼠脑组织具有正常的组织形态,细胞间隙正常,神经细胞呈现有序的排列,胞核形状均匀规则。ICH组细胞间隙增加,血肿周边受损脑组织可见明显水肿,神经细胞胞体皱缩,胞浆嗜酸性减弱,细胞核固缩。BMSCs组受损脑组织形态改变基本如同ICH组,但周边组织水肿较轻,变性、坏死的神经细胞明显较少;4 BMSCs在血肿周围受损脑组织内的分布:BMSCs移植前,免疫荧光结果显示无雄鼠来源的Sry阳性细胞。12小时,Sry蛋白在BMSCs胞核中呈颗粒状表达。之后阳性细胞数呈逐渐增多的趋势,于移植后3天达到峰值。直至14天时血肿周围受损脑组织内仍可见Sry阳性细胞;5 TUNEL染色检测结果:Sham组间或可见TUNEL阳性细胞的表达,零星分布,着色浅淡。ICH组1-7天TUNEL阳性细胞簇状出现,其阳性细胞积分光密度值高于Sham组,差异显著(P0.05)。BMSCs组TUNEL阳性细胞表达趋势与ICH组类似,但积分光密度值与ICH组相比显著降低(P0.05)。6脑组织含水量测定:Sham组脑组织含水量无明显变化。ICH组与Sham组相比,在造模术后1,3和7天的脑组织含水量均显著升高(P0.05)。BMSCs组大鼠1,3和7天的脑组织含水量均低于ICH组,差异显著(P0.05)。7 ICH后神经功能障碍的评估:ICH导致了大鼠严重的神经功能障碍。BMSCs组大鼠在术后第3,7和14天的前肢放置率、转角率均显著高于ICH组(P0.05),而NSS评分则显著低于ICH组(P0.05)。小结:BMSCs的原代培养、传代和鉴定;采用注血法成功建立了大鼠ICH模型;大鼠ICH后血肿周围脑组织受损,导致ICH大鼠神经功能障碍;给予BMSCs移植治疗后,可以发挥一定神经保护作用,减轻血肿周围脑组织受损程度,改善脑水肿和ICH大鼠神经功能障碍情况。第二部分骨髓间充质干细胞移植通过PI3K-Akt-m TOR通路对脑出血大鼠自噬和轴突再生的影响目的:通过PI3K-Akt-m TOR通路抑制剂LY294002的干预,探讨大鼠ICH后BMSCs移植能否通过PI3K-Akt-m TOR通路影响受损脑组织内的自噬和轴突再生。方法:102只雌性SD大鼠被随机分为四组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group);4)脑出血+BMSCs移植+LY294002干预组(LY294002 group)。动物模型制作及BMSCs移植同第一部分,取术后12小时、1天、3天、7天、14天5个时间对下列指标进行检测:1)透射电镜观察大鼠ICH后受损脑组织超微结构,检测自噬体;2)Western-blot检测ICH后受损脑组织轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10,自噬相关蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表达;3)免疫组化检测受损脑组织内GAP-43的表达及定位;4)免疫荧光观察受损脑组织内p-Akt和m TOR的共聚焦结果。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1透射电镜结果:ICH造模术后3天,在皱缩的神经细胞的胞核四周可以观察到许多肿胀及变形的线粒体,此时亦有受损的线粒体及其他细胞结构被双层膜样结构所环绕,它们进入溶酶体中并与之融合,最终形成了自噬溶酶体;2 p-Akt的免疫印迹分析结果:Sham组p-Akt蛋白低表达。ICH组大鼠受损脑组织内p-Akt在造模手术后12小时升高,至3天达到峰值,之后逐渐降低,在各时间点p-Akt与Akt的比值都高于Sham组(P0.05)。BMSCs组p-Akt变化趋势与ICH组类似,但各时间点p-Akt与Akt的比值进一步升高(P0.05)。而LY294002组与BMSCs组相比p-Akt与Akt的比值降低,差异显著(P0.05);3 p-Akt(红色荧光)和m TOR(绿色荧光)的免疫荧光共聚焦结果:Sham组红色和绿色荧光表达较少,重叠后可见少量的黄色聚集。ICH组造模后3天血肿周围受损脑组织内可见比Sham组中略强的红色及绿色荧光,重叠后呈橘黄色。BMSCs组红色及绿色荧光比ICH组更强,重叠后橘黄色加重。而经PI3K-Akt-m TOR通路抑制剂LY294002干预后,红色及绿色荧光较BMSCs组明显减弱,重叠后的橘黄色荧光亦减弱;4 LC3的免疫印迹分析结果:Sham组LC3II蛋白低表达。ICH组受损脑组织内LC3II与LC3I的比值于术后12小时升高,3天达到峰值,之后降低但仍高于Sham组(P0.05)。BMSCs组LC3II与LC3I比值的变化趋势与ICH组类似,但其表达量与ICH组相比较有进一步升高,差异显著(P0.05)。而与BMSCs组相比,LY294002干预能明显降低LC3II与LC3I的比值(P0.05);5 p62的免疫印迹分析结果:Sham组p62的蛋白表达未见明显差异。ICH组术后1天受损脑组织内p62表达降低,3天达到最低值,虽然之后表达稍有升高,但仍低于Sham组,差异显著(P0.05)。BMSCs组p62表达的趋势类似ICH组,但其在各时间点的表达量均明显低于ICH组(P0.05)。但LY294002干预后,p62的表达强度与BMSCs组相比明显升高(P0.05);6 GAP-43免疫组化检测结果:Sham组间或可见零星分布GAP-43的阳性细胞的表达。ICH组在术后1-7天可见GAP-43阳性细胞明显增加,免疫反应性与Sham组相比显著增强(P0.05)。BMSCs组3-7天GAP-43阳性细胞的免疫反应性与ICH组比较进一步增强,差异显著(P0.05)。而LY294002干预导致GAP-43阳性细胞的免疫反应性与BMSCs组相比明显降低(P0.05);7 GAP-43的免疫印迹分析结果:Sham组GAP-43的蛋白表达未见明显差异。ICH组造模术后3天受损脑组织GAP-43表达升高,虽然7天和14天GAP-43稍有降低,但仍高于Sham组,差异显著(P0.05)。BMSCs组GAP-43的表达趋势类似ICH组,但其在各时间点的表达量均进一步升高(P0.05)。而LY294002干预后,GAP-43的表达强度与BMSCs组相比明显降低(P0.05);8 SCG10的免疫印迹分析结果:Sham组SCG10的蛋白表达未见明显差异。ICH组受损脑组织内SCG10于造模术后12小时升高,3天达峰值,之后逐渐降低但仍高于Sham组(P0.05)。BMSCs组SCG10的表达趋势与ICH组类似,但其在各时间点的表达量均降低,差异显著(P0.05)。而LY294002干预后与BMSCs组相比能明显提高SCG10的表达强度(P0.05)。小结:ICH后血肿周围受损脑组织内的神经细胞存在自噬和PI3K-Akt-m TOR通路的激活;给予BMSCs移植治疗后,PI3K-Akt-m TOR通路进一步激活,血肿周围受损脑组织内的自噬流增加,同时轴突再生增强;而BMSCs移植对自噬流强度和轴突再生相关蛋白的表达均受PI3K-Akt-m TOR信号通路的调控。第三部分大鼠脑出血后骨髓间充质干细胞移植通过自噬流介导轴突再生的机制研究目的:通过自噬抑制剂3MA和自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)的干预,明确大鼠ICH后BMSCs移植是否通过促进血肿周围受损脑组织内的自噬流介导了轴突再生。方法:45只雌性SD大鼠被随机分为五组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group);4)脑出血+BMSCs移植+3-MA干预组(3MA group);5)脑出血+BMSCs移植+RAPA干预组(RAPA group)。在术后3天对下列指标进行检测:1)免疫荧光观察受损脑组织内LC3和不同细胞标记物的共聚焦情况;2)Western-blot检测ICH后受损脑组织轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10,自噬相关蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表达;3)免疫组化检测受损脑组织内GAP-43的表达及定位。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1 LC3和细胞标记物的免疫荧光共聚焦结果:红色荧光标记LC3,绿色荧光标记神经元,洋红色荧光标记星形胶质细胞,蓝色荧光标记细胞核。Sham组红色荧光表达较少,能与绿色荧光重叠,可见少量的橘黄色聚集。ICH组受损脑组织内胞浆中可见比Sham组多的红色荧光,而绿色荧光明显减少,重叠后呈橘黄色,提示ICH后神经细胞自噬。同时洋红色荧光要多于Sham组,提示ICH后星形胶质细胞增生。BMSCs组红色及绿色荧光均比ICH组更多,重叠后橘黄色加重,提示BMSCs移植治疗进一步激活了神经细胞自噬,也减少了神经细胞的死亡。同时洋红色荧光少于ICH组,提示BMSCs能抑制ICH后的星形胶质细胞增生。经自噬抑制剂3MA干预后,与BMSCs组相比红色荧光减少,而绿色荧光略减少,重叠后橘黄色亦减弱,洋红色荧光无显著变化。经自噬激活剂RAPA干预后,与BMSCs组相比红色荧光显著增强,而绿色荧光无显著变化,重叠后橘黄色加重明显,洋红色荧光亦无显著变化;2自噬相关蛋白LC3和p62的免疫印迹分析结果:ICH大鼠受损脑组织内LC3II与LC3I比值显著高于Sham组(P0.05),而p62表达显著低于Sham组(P0.05),提示ICH后自噬流的激活。BMSCs移植治疗能够进一步升高LC3II与LC3I比值(P0.05),而p62表达量进一步降低(P0.05),提示BMSCs能够增强自噬流。当给予自噬抑制剂3MA干预后,自噬被抑制,LC3II与LC3I比值降低(P0.05),而p62表达增强(P0.05)。自噬激活剂RAPA具有相反的作用,导致了LC3II与LC3I比值再一次升高(P0.05),p62表达则再一次降低(P0.05);3轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10的免疫印迹分析结果:ICH大鼠受损脑组织内GAP-43和SCG10表达均高于Sham组(P0.05)。BMSCs移植治疗能够进一步升高GAP-43的表达(P0.05),而SCG10表达降低(P0.05)。当给予自噬抑制剂3MA干预后,GAP-43的表达降低(P0.05),而SCG10表达增强(P0.05)。自噬激活剂RAPA具有相反的作用,导致了GAP-43表达再次升高(P0.05),而SCG10表达则进一步降低(P0.05);4 GAP-43的免疫组化检测结果:Sham组可见零星分布的阳性细胞的表达,着色很淡。ICH大鼠受损脑组织内可见GAP-43阳性细胞明显增加,着色亦加深,免疫反应性与Sham组相比显著增强(P0.05)。经BMSCs移植治疗后GAP-43阳性细胞进一步增加,免疫反应性进一步增强,差异显著(P0.05)。自噬抑制剂3MA干预后,与BMSCs组比较GAP-43阳性细胞免疫性降低(P0.05),而自噬激活剂RAPA对GAP-43阳性细胞无显著影响;5 p-Akt的免疫印迹分析结果:造模术后3天,ICH组p-Akt与Akt的比值显著高于Sham组(P0.05),而BMSCs移植治疗能够进一步升高p-Akt与Akt的比值(P0.05)。然而,自噬抑制剂3MA和自噬激活剂RAPA对p-Akt与Akt的比值无显著影响。小结:大鼠ICH后BMSCs移植可通过增强受损脑组织内神经细胞的自噬流强度促进轴突再生。结论:ICH后BMSCs移植能够发挥神经保护作用,改善神经功能障碍,其分子机制或许与激活的PI3K-Akt-m TOR通路促进了受损脑组织内自噬流介导的轴突再生有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34

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