木鳖子对羟基桂皮醛通过调控cAMP-RhoA-MAPK途径诱导食管鳞状细胞癌分化作用研究

发布时间：2018-06-15 10:29

本文选题：食管鳞状细胞癌 + 食管癌前病变　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分CMSP对ESCC细胞的分化诱导作用目的:本课题通过研究木鳖子乙醇提取物对羟基桂皮醛(p-Hydroxylcinnamaldehyde,CMSP)对ESCC细胞增殖、侵袭、迁移及肿瘤标志蛋白表达水平等方面的影响,探讨CMSP对ESCC细胞的分化诱导作用。通过以上研究为CMSP作为分化诱导剂应用于食管癌的临床治疗提供科学依据。方法:1 MTS法检测不同浓度CMSP分别作用不同时间,对ESCC细胞(Kyse30、TE-13、Eca109及Kyse180)及正常食管上皮细胞株HEEC增殖活性的影响。2流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测不同浓度CMSP分别作用于ESCC细胞株Kyse30及TE-13后,对细胞周期分布及凋亡水平的影响。3在光镜及电镜下分别观察CMSP作用后,对Kyse30及TE-13形态的影响。4通过实时荧光定量反转录PCR(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和ELISA技术分别从mRNA及蛋白分泌水平检测CMSP对Kyse30及TE-13表达肿瘤相关抗原CEA、SCC及肿瘤标志物IL-6、MIC-1水平的影响。5通过Western blotting技术检测CMSP对Kyse30及TE-13肿瘤标志物C-myc及N-myc蛋白表达水平的影响。6通过克隆形成实验检测CMSP对Kyse30及TE-13细胞克隆形成能力的影响;并通过Transwell小室及细胞划痕实验检测CMSP对Kyse30及TE-13细胞侵袭、迁移能力的影响。同时采用Western blotting技术检测CMSP对Kyse30及TE-13细胞中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白MMP2、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表达水平的影响。结果:1cmsp可呈剂量及时间依赖性抑制escc细胞株(kyse30、te-13、eca109及kyse180)的增殖活性(p0.01),但对正常食管上皮细胞株heec增殖活性无明显抑制作用(p0.05)。210-40μg/mlcmsp作用后,kyse30及te-13中周期阻滞于g0/g1期的细胞比例明显增高(p0.01),但10-40μg/mlcmsp作用后,annexinv-fitc表达阳性细胞比例无明显变化,因此提示cmsp对escc细胞的抑制作用不依赖于诱导凋亡(p0.05)。3cmsp作用后,kyse30及te-13细胞可呈明显梭形改变,且梭形细胞比例随着cmsp浓度的增高而增加(p0.01)。4cmsp作用后,kyse30及te-13细胞中cea、scc、il-6、mic-1mrna及蛋白的表达水平均明显下降,且该作用可呈明显剂量及时间依赖性(p0.05)。5cmsp作用后,kyse30及te-13细胞中c-myc及n-myc蛋白的表达水平均明显下降,且该作用可呈明显剂量及时间依赖性(p0.05)。6与cmsp共培养的kyse30和te-13细胞,其克隆形成及迁移、侵袭能力均明显下降(p0.05),同时,细胞中mmp2及肿瘤细胞间质型标志vimentin、n-cadherin的表达水平均明显下降(p0.01),而上皮型标志e-cadherin的表达水平明显增加(p0.05)。结论:1cmsp可明显抑制escc细胞增殖、迁移、侵袭及克隆形成能力,并可显著抑制escc细胞中肿瘤相关抗原及肿瘤标志物的表达水平。2cmsp可能是通过诱导细胞分化,而非诱导凋亡作用抑制escc细胞的生物活性。3cmsp对正常食管上皮细胞株heec无明显抑制作用,因此提示该药可能具有较小的毒副作用。第二部分cmsp对escc细胞分化诱导作用的机制研究目的:深入探讨cmsp诱导escc细胞分化的作用机制,为cmsp应用于escc的综合治疗提供科学依据。方法:1采用同位素相对标记与绝对定量质谱技术(relativeisotopiclabelingandabsolutequantification,itraq)分析cmsp作用后kyse30细胞中表达程度变化(3倍)的蛋白,并对表达水平变化的蛋白进行go(geneontology)及pathway分析,筛选cmsp可能作用的细胞信号转导途径,初步研究cmsp对escc细胞的分化诱导作用的可能机制。2elisa实验检测cmsp对kyse30及te-13细胞中camp表达水平的影响。3采用westernblotting技术检测cmsp对kyse30及te-13中rhoa、p-38、p-p38、erk1/2、p-erk1/2、sapk/jnk及p-sapk/jnk表达水平的影响。4pulldown技术检测cmsp对kyse30及te-13中gtp-rhoa表达水平的影响。5为深入探讨cmsp诱导escc细胞分化作用的机理,我们还观察了camp活性抑制剂sq22536对cmsp诱导kyse30及te-13分化作用的影响。6分别观察camp活性促进剂forskolin、erk途径抑制剂pd98059及jnk途径抑制剂sp600125作用后,kyse30及te-13生物活性的变化,探讨forskolin、pd98059及sp600125对escc细胞分化作用的影响。结果:1itraq分析结果显示cmsp作用后,kyse30细胞中有79中蛋白表达水平下降,而103种蛋白表达水平增高,经过go及pathway分析,我们发现其中能注释到的蛋白共176种,这些蛋白参与了细胞多种生命活动以及生物化学反应过程,且涉及了cmsp作用后escc细胞中肌动蛋白细胞骨架调节、camp、胰岛素、剪接体、mapk及rho等多条信号转导通路。2cmsp作用后,kyse30及te-13细胞中camp、p-p38的表达水平均明显上升(p0.05),而gtp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表达水平均明显下降(p0.05)。3camp抑制剂sq22536作用后,cmsp对kyse30及te-13细胞的增殖抑制及细胞周期阻滞作用均明显减弱(p0.01);sq22536作用后,kyse30及te-13细胞中cea、scc、il-6、mic-1,c-myc及n-myc的表达水平明显增高(p0.01),同时细胞gtp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表达水平均明显增高(p0.01),但p-p38的表达水平无明显变化(p0.05)。4forskolin、pd98059及sp600125分别作用后,均可对kyse30及te-13细胞产生类似于cmsp的诱导分化作用。因此,对camp-rhoa-erk/jnk通路的调控作用可能是cmsp诱导escc分化作用的主要机制,但p38通路在cmsp分化诱导中的作用及其具体机制仍有待进一步研究。结论:cmsp对escc细胞的分化诱导能力与该药作用后影响camp-rhoa-mapk通路的活性有关,cmsp作用后,表达水平增高的camp通过抑制rhoa活化,进而抑制erk/jnk途径的活性可能是cmsp对escc细胞诱导分化作用的主要机制。第三部分cmsp抑制食管癌细胞裸鼠移植瘤生长的作用及机制研究目的:构建裸鼠食管癌kyse30细胞荷瘤裸鼠模型,研究cmsp在体内环境中对escc细胞的分化诱导作用,以探讨cmsp对escc细胞体内生物活性的影响。方法:1通过皮下结合尾静脉注射法构建裸鼠食管癌kyse30细胞荷瘤肺转移balb-c/null裸鼠模型,实验分为5组,第11d开始瘤旁注射药物,对照组:每3d瘤旁注射灭菌100μlpbs;cmsp低剂量组:每3d瘤旁注射100μlcmsp(10mg/kg体重);cmsp高剂量组:每3d瘤旁注射100μlcmsp(20mg/kg体重);atra治疗组:每3d瘤旁注射100μlatra(10-2mmol/kg体重);cddp治疗组:每3d瘤旁注射100μlcddp(2mg/kg体重)。第32d引颈处死各组裸鼠。2观察各组裸鼠移植瘤的生长速度及瘤重。3免疫组化及pulldown技术研究各组裸鼠瘤组织中肿瘤标志物c-myc、n-myc,emt相关蛋白mmp2、e-cadherin、n-cadherin、vimentin及gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的表达水平。4elisa实验检测裸鼠外周血中肿瘤分化相关抗原(cea及scc)及肿瘤标志物(il-6及mic-1)的含量。5he染色观察肺组织转移瘤结节的形成。6he染色观察肝、脾、肾等重要脏器的病理改变以评价cmsp对机体的毒副作用。结果:1实验结果显示,cddp、atra及不同浓度cmsp处理组裸鼠肿瘤组织的体积和瘤重均明显低于对照组(p0.05),且cmsp处理组瘤组织中未见明显的凋亡与坏死灶,这与atra处理组瘤组织的表现是一致的;而cddp组裸鼠瘤组织可见明显凋亡与坏死灶。2裸鼠外周血中分泌型肿瘤相关抗原cea、scc及肿瘤标志物il-6、mic-1的含量均明显下降(p0.05),同时瘤组织中肿瘤标志蛋白c-myc与n-myc蛋白的表达水平也明显下降(p0.01)。3对照组裸鼠肺组织中,光镜下可见大小不一的escc细胞转移结节,而cmsp低、高剂量治疗组肺组织中均未发现转移肿瘤结节,这提示cmsp在体内环境中也具有明显抑制肿瘤侵袭、转移的功能。4免疫组化结果显示cmsp作用后,肿瘤组织中mmp2及肿瘤间质型标志蛋白n-cadherin和vimentin的表达水平均明显降低(p0.01),而上皮型标志蛋白e-cadherin的表达水平明显增加(p0.01),因此cmsp在体内环境中依然可通过抑制肿瘤上皮-间质转换而抑制肿瘤转移。同时,免疫组化及pulldown结果显示cmsp作用后,肿瘤组织表达gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的水平均明显减低(p0.05)。5裸鼠肝、脾、肾等重要脏器未见明显组织病理学改变,提示该药具有较小的毒副作用。结论:在体内环境中,cmsp依然可通过分化诱导作用抑制escc移植瘤的生长、侵袭活性,进一步提示了该药物在escc综合治疗中的广泛前景。第四部分cmsp逆转小鼠食管癌前病变进程及其免疫调节作用研究目的:通过喂食含4nqo饮用水构建小鼠食管癌前病变模型,腹腔注射cmsp观察其对食管癌前病变及机体免疫功能的影响,从而深入地探讨cmsp对escc发生、发展过程的影响,为cmsp应用于escc的综合防治提供科学数据。1通过喂食含100μg/ml4nqo饮用水法,构建小鼠c57bl/6食管癌前病变模型小鼠,实验分为空白对照组,模型组,cmsp预防组,cmsp治疗组及atra治疗组。实验持续30w。空白对照组30w内均给予无菌蒸馏水;模型组小鼠在1-15w给予100μg/ml的4nqo,16-30w给予无菌蒸馏水;cmsp预防组小鼠,在1-15w给予100μg/ml的4nqo,同时从第1w起,每周三次腹腔注射cmsp(20mg/kg体重);cmsp治疗组小鼠,在1-15w给予100μg/ml的4nqo,同时从第16w起,每周三次腹腔注射cmsp(20mg/kg);atra治疗组小鼠,在1-15w给予100μg/ml的4nqo,同时从第16w起,每周三次腹腔注射atra(10-2mmol/kg)。2实验过程中,每周三次称取小鼠体重,并观察小鼠一般状态;处死小鼠后,取各食管组织,通过he染色观察各组小鼠食管癌前病变进展情况。3免疫组化、westernblotting及pulldown技术研究病变组织中肿瘤标志物c-myc、n-myc及gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的表达水平。4elisa法小鼠外周血中肿瘤分化相关抗原(cea及scc)及肿瘤标志物(il-6及mic-1)的含量。5通过mts法观察各组小鼠脾淋巴细胞增殖活性;elisa法检测外周血中ifn-γ、tnf-α及分泌型b7-h4(secretoryb7-h4,sb7-h4)含量;fcm检测小鼠外周血淋巴细胞亚群状态;免疫组化技术检测食管病变组织b7-h4、stat3及p-stat3的表达水平,全面评价cmsp对模型小鼠机体免疫功能状态的影响及其机制。6观察各组小鼠肝、脾、肾等重要脏器的病理改变以评价cmsp对机体的毒副作用。结果:1小鼠食管癌前病变模型实验结果显示cmsp治疗组和预防组小鼠的癌前病变发生率及病变程度均明显低于模型对照组小鼠(p0.05),一般状态也明显改善,且cmsp预防组小鼠癌前病变的发生率和病变程度均明显低于cmsp治疗组(p0.05),这提示cmsp对食管癌前病变具有良好的预防作用。我们同时发现,cmsp治疗组与atra治疗组小鼠的疗效无显著差异(p0.05),这进一步提示cmsp具有作为分化诱导药物应用于临床食管癌治疗的潜力。2cmsp预防组和治疗组小鼠外周血中肿瘤相关抗原cea与scc,及肿瘤标志物mic-1及il-6的含量均较模型对照组明显降低(p0.01),病变组织表达肿瘤标志蛋白c-myc及n-myc的表达水平也均明显减低(p0.01)。3cmsp治疗及预防组小鼠食管组织中gtp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表达水平较模型组明显下降(p0.05)。4模型组小鼠随着诱导时间的延长,外周血淋巴细胞数量、增殖活性及脾脏指数均明显下降(p0.05),而cmsp治疗及预防组小鼠外周血淋巴细胞数量及其对cona刺激后的增殖活性均明显高于模型组(p0.05),同时脾脏指数也明显增高(p0.05)。5fcm结果显示,模型组小鼠随着诱导时间的延长,其外周血中cd4~+t细胞、cd8~+t细胞及nk细胞的比例均明显减低(p0.01),而cd4~+cd25~+调节性t细胞比例明显增高,而cmsp治疗和预防组小鼠cd4~+t细胞、cd8~+t细胞及nk细胞的比例均明显高于模型组(p0.05),cd4~+cd25~+调节性t细胞比例则明显低于模型组(p0.05)。6随着诱导时间的延长,模型组小鼠外周血中sb7-h4、il-6及mic-1含量明显增高(p0.01),而ifn-γ及tnf-α含量逐渐下降(p0.01);同时食管组织表达b7-h4、stat3及p-stat3的水平均明显增加(p0.01)。cmsp治疗及预防组小鼠外周血中sb7-h4、il-6及mic-1含量均较模型组明显降低(p0.01),而ifn-γ及tnf-α含量明显增高(p0.01);同时食管组织表达b7-h4、stat3及p-stat3的水平均明显低于模型组小鼠(p0.01),故cmsp对食管癌前病变模型机体免疫功能的促进作用可能与其抑制病变组织b7-h4的表达、从而抑制b7-h4/stat3通路的表达有关。7cmsp预防和治疗组肝、脾、肾未见任何异常病理改变,进一步说明该药可能具有较小的毒副作用。结论:1cmsp可通过诱导分化作用逆转食管癌前病变进展过程。2cmsp可通过抑制食管癌前病变组织b7-h4的表达、从而抑制病变组织b7-h4/stat3通路的表达,纠正机体在癌前病变进展过程中免疫功能的紊乱状态。3cmsp可能具有较小的毒副作用,因此在escc综合防治中具有广泛前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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