MicroRNA-21表达与前列腺癌临床病理特征及预后相关性的临床和机制研究

发布时间：2018-06-18 02:36

本文选题：前列腺癌 + miR-21　；参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景及意义前列腺癌是威胁男性健康的常见恶性肿瘤之一。早期前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)筛查存在一定的假阴性和假阳性,因此寻找更合适的前列腺癌筛查指标具有重要意义。核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)型生物标志物具有检测方便、准确性高、在血液循环中稳定存在等诸多优势,是十分有潜力的生物标志物。微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)可通过调节下游靶基因,促进细胞增殖、侵袭和迁移等机制,影响包括前列腺癌在内的多种恶性肿瘤。现有研究主要集中在前列腺肿瘤组织中的miR-21表达情况。由于在临床中需通过侵袭性操作获得前列腺组织活检样本来测定miR-21表达,程序复杂,易对患者造成伤害且较难获得连续性的动态监测数据,因此需要一种更加敏感特异,能够预测前列腺癌进展,并且易于获得样本进行连续性检测的生物标志物。近期大量的研究证实,外周血循环中的miRNA异常表达有肿瘤相关特异性和高度的敏感性,因此miRNA可能成为一种潜在的生物标记物。前列腺癌早期症状隐匿,晚期可发生远处转移尤其是骨转移。因此,研究前列腺癌转移机制,寻找潜在的治疗靶点,对于抑制前列腺癌,减少前列腺癌相关死亡具有重要意义。miRNA在前列腺癌发生和转移中的作用和机制是目前研究的焦点之一,已有研究证实miR-21与前列腺癌进展具有相关性,可能在前列腺癌的发生、转移中发挥重要作用。虽然前列腺癌的诊治已经有了许多新进展,但是目前对于前列腺癌转移机制仍不明确。本研究分为两部分。第一部分,首先观察外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)miR-21在前列腺癌患者的表达情况,然后探讨其表达程度与前列腺癌临床病理特征的相关性,最后分析PBMC中miR-21的表达与前列腺癌诊断及术后生化复发的关系。第二部分研究miR-21下调与前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的相关性,同时观察和分析与肿瘤细胞增殖和迁移相关蛋白的表达变化情况,以进一步探讨miR-21表达与前列腺癌进展的关系。第一部分研究目的:研究PBMC中miR-21的表达与前列腺癌Gleason评分、PSA水平、TNM分期等临床病理特征的相关性,及其与前列腺癌诊断和术后生化复发的关系,探讨miR-21成为前列腺癌诊断和预测的生物标志物的可能性。研究方法:利用实时定量聚合酶链式反应技术(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测92例前列腺癌患者、85例良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)患者及97例健康对照的PBMC中miR-21的表达情况,统计分析PBMC中miR-21的相对表达量与年龄、Gleason评分、PSA水平、TNM分期、前列腺癌危险因素分级的相关性,ROC曲线分析miR-21对前列腺癌的诊断价值,Kaplan-Meier方法及log-rank检验对根治性前列腺切除术后患者无生化复发生存率进行分析,同时利用Cox风险回归模型分析生化复发的影响因素及相对危险度。研究结果:qRT-PCR结果显示,前列腺癌患者PBMC中miR-21相对表达量(2.61±0.88),较 BPH 患者(1.34±0.50)和对照组(1.24±0.47)显著增高(P0.001)。在92例前列腺癌患者中,Gleason评分≤7分和Gleason评分7分的两组患者PBMC 中 miR-21 相对表达量分别为 2.38±0.82 和 2.76±0.88(P0.05)。在 T1、T2、T3、T4各期患者中,PBMC中miR-21相对表达量分别为2.28±0.83、2.44±0.50、2.74±1.12 和 3.62±0.64(F=7.249,P0.001)。区域淋巴结转移(N1)患者PBMC中miR-21的相对表达量高于无区域淋巴结转移(N0)患者(2.94±0.98 VS2.41±0.75,P0.01)。远处转移(M1)患者PBMC中miR-21相对表达量高于无远处转移(M0)患者(4.30±0.83VS2.45±0.69,P0.001)。此外,PBMC中miR-21在低、中、高危前列腺癌患者中的相对表达量分别为1.74±0.41、2.51±0.86 和 2.89±0.81(F=15.192,P0.001)。不同年龄段和不同血清 PSA 水平患者PBMC中miR-21相对表达量无明显差异(P0.05)。根据所有前列腺癌患者和BPH患者PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,曲线下面积(Area under the curve,AUC)为0.917,敏感度和特异度分别为84.8%和83.5%,临界值(Cut-off值)1.838。根据所有前列腺癌患者和健康对照组PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,AUC为0.938,敏感度和特异度分别为87.0%和86.6%,Cut-off值1.755。对于PSA≤1Ong/ml的前列腺癌患者和BPH患者,根据PBMC中miR-21表达水平绘制ROC曲线,AUC为0.862,敏感度和特异度分别为76.9%和74.7%,Cut-off值1.728;根据PSA水平绘制ROC曲线,AUC为0.868,敏感度和特异度分别为76.9%和75.9%,Cut-off值4.750;联合miR-21和PSA两种检测结果,并根据logistic回归方程计算出的联合预测因子绘制ROC曲线,AUC为0.946,敏感度和特异度分别为92.3%和86.7%,Cut-off值2.793。Kaplan-Meier生存曲线显示,miR-21相对低表达组的1年、3年、5年无生化复发生存率分别为100%、92.4%和65.7%,miR-21相对高表达组的1年、3年、5年无生化复发生存率分别为92.9%、39.0%和20.8%,两组经log-rank检验P0.001。Cox风险回归模型显示,PBMC中的miR-21表达水平、Gleason评分和临床T分期是影响患者术后生化复发的危险因素,其相对危险度Exp(B)分别为 3.940(P=0.006)、5.645(P=0.008)和 3.618(P=0.016)。研究结论:miR-21在前列腺癌患者PBMC中表达增高,其表达异常程度与Gleason评分、肿瘤TNM分期和前列腺癌危险因素分级具有相关性。PBMC中miR-21的异常表达对前列腺癌具有较高的诊断价值,联合PSA检测可提高对PSA≤10ng/ml患者前列腺癌诊断的敏感性和特异性。PBMC中miR-21表达增高,前列腺癌根治术后患者生化复发风险增高,是影响术后生化复发的因素之一。综上所述,PBMC中miR-21与前列腺癌的临床病理及术后生化复发具有明确相关性,可能成为前列腺癌诊断和预测术后生化复发的潜在生物标志物。第二部分研究目的:观察miR-21表达下调对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,并探讨miR-21低表达对非受体蛋白酪氨酸磷酸酶14(Tyrosine protein phosphatase non-receptor 14,PTPN14)、同源性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)、基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloprotease2,MMP2)和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotease9,MMP9)表达的影响,探索前列腺癌治疗的潜在靶点。研究方法:首先采用qRT-PCR方法检测了正常前列腺上皮细胞系PrEC及前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145中miR-21的表达情况,然后利用RNA干扰(RNAinterfereing,RNAi)技术制备 miR-21 低表达的 DU145-AMO 细胞,同时以DU145-SCR为阴性对照,DU145为空白对照,进行噻唑蓝比色分析细胞增殖,Tanswell小室侵袭实验对肿瘤细胞的侵袭能力进行观察、划痕实验对细胞迁移能力进行验证,同时采用Western Blot蛋白检测方法对PTPN14、PTEN、MMP2和MMP9的表达情况进行观察。研究结果:前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145中miR-21的相对表达量,均显著高于正常前列腺上皮细胞PrEC(P均0.05)。噻唑蓝比色分析显示,低表达miR-21的DU145-AMO细胞,生长曲线OD值显著低于对照组的DU145细胞,生长速度减慢(P0.05)。Tanswell小室侵袭实验显示滤膜下室面DU145-AMO细胞数量少于DU145和DU145-SCR组的细胞数(均P0.01)。细胞划痕实验显示划痕中央迁移的DU145-AMO组的细胞数少于DU145-SCR组的细胞数(PP0.05)。Western Blot结果显示敲低miR-21表达的DU145-AMO细胞中,PTPN14和PTEN的表达量较DU145分别增高78%(P0.01)和98%(P0.001),较 DU145-SCR 分别增高 79%和 57%(P均0.01),而 MMP2、MMP9表达较DU145分别下降71%和61%(P均0.001),较DU145-SCR分别下降 70%和 64%(P 均0.001)。研究结论:miR-21在前列腺癌细胞中高表达,下调miR-21的表达可抑制前列腺癌细胞DU145的体外增殖、侵袭和迁移,这种抑制作用可能是通过上调PTPN14和PTEN表达,以及下调MMP2和MMP9表达实现的。因此miR-21可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点。本课题研究结论前列腺癌患者PBMC中miR-21表达显著增高,其异常表达程度与Gleason评分、肿瘤TNM分期和前列腺癌危险因素分级具有相关性。PBMC中miR-21的异常表达对前列腺癌有较高的诊断价值,联合PSA化验可提高对PSA≤10ng/ml患者前列腺癌诊断的敏感性和特异性。PBMC中miR-21表达增高,前列腺癌根治术后患者生化复发风险增高,是影响术后生化复发的因素之一。miR-21在前列腺癌细胞中高表达,下调miR-21的表达可抑制前列腺癌细胞DU145的体外增殖、侵袭和迁移,这种抑制作用可能是通过.上调PTPN14和PTEN表达,以及'下调MMP2和MMP9表达实现的。综上所述,miR-21与前列腺临癌临床病理特征及前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有相关性。希望今后通过大样本的研究,进一步探讨miR-21在前列腺癌诊断、预测预后及治疗中的作用。
[Abstract]:This paper studies the expression of miR - 21 in prostate cancer patients and the relationship between the expression of miR - 21 and prostate cancer . It is suggested that miRNA - 21 ( microRNA - 21 , miR - 21 ) can be used to detect the progression of prostate cancer . The expression of miR - 21 in PBMCs of 92 patients with prostate cancer , 85 patients with benign prostatic hyperplasia ( BPH ) and 97 healthy controls was analyzed by quantitative real - time polymerase chain reaction ( qRT - PCR ) . The relative expression of miR - 21 was 2.28 卤 0.83 , 2.44 卤 0.50 , 2.74 卤 1.12 and 3.62 卤 0.64 ( F = 7.249 , P0.001 ) . The relative expression of miR - 21 in PBMC of patients with regional lymph node metastasis ( N1 ) was higher than that in patients without regional lymph node metastasis ( N0 ) ( 2.94 卤 0.98 VS2.41 卤 0.75 , P0.01 ) . The relative expression of miR - 21 in PBMC of patients with distant metastasis ( M1 ) was higher than that in patients without distant metastasis ( M0 ) ( 4.30 卤 0.83 VS2.45 卤 0.69 , P0.001 ) . In addition , the relative expression levels of miR - 21 in patients with low , medium , and high - risk prostate cancer were 1.74 卤 0.41 , 2.51 卤 0.86 and 2.89 卤 0.81 ( F = 15.192 , P0.001 ) , respectively . The expression levels of miR - 21 in PBMCs of patients with prostate cancer and in healthy control group were 76.9 % and 86.5 % respectively , and the cut - off value was 1.838 . Results showed that miR - 21 expression level , sensitivity and specificity were respectively 76.9 % and 86.6 % , cut - off value 1.728 , and the sensitivity and specificity of miR - 21 were 0.946 , 5.645 ( P = 0.008 ) and 3.618 ( P = 0 . 016 ) , respectively . In conclusion , the expression of miR - 21 in prostate cancer cell line LNCap , PC3 , DU145 was significantly higher than that of normal prostate epithelial cell line LNCap , PC3 , DU145 . Compared with the DU145 - SCR group , the number of cells in DU145 cells was decreased by 78 % ( P0.01 ) and 98 % ( P < 0.01 ) , while those of DU145 - SCR increased by 71 % and 61 % respectively ( P < 0.001 ) , while the DU145 - SCR decreased by 70 % and 64 % ( P < 0.001 ) . Conclusion : miR - 21 is highly expressed in prostate cancer cells , down - regulation of miR - 21 expression can inhibit the proliferation , invasion and migration of prostate cancer cell DU145 in vitro .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25

【参考文献】