帕金森病血清miRNA生物标记物的研究

发布时间：2018-10-13 14:43

【摘要】：研究背景帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种世界第二大类并与年龄密切相关的神经退行性疾病。65岁以上人群中发病率是1～2%,85岁以上为4～5%。并且随着人口老龄化,PD的患病人数每年都在递增。PD的临床症状主要包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态障碍等运动症状,以及嗅觉障碍、便秘、神经精神障碍、认知障碍、自主神经功能障碍等非运动症状。随着疾病的发展,大多数患者最终将失去生活自理能力,严重影响了患者的日常生活和工作,给家庭和社会带来不可估量的负担。目前,诊断治疗PD面临的难题主要有:(1)发病机制不清:PD的发病受多种因素影响,目前认为主要是在老龄化的基础上,遗传和环境共同作用造成的。许多研究显示PD患者黑质多巴胺能(DA)神经元变性可能与线粒体功能障碍、氧化应激、神经营养因子缺乏、兴奋性毒性、免疫调节异常、细胞调亡等一系列机制有关。流行病学调查研究显示,约有5～10%的帕金森病患者有家族史。但只有6个被证实能够引起遗传性单基因突变,表明帕金森病的发病与遗传因素密切相关。(2)缺乏客观的实验室诊断方法:PD异质性高,目前除了影像方法辅助以外,统一帕金森病评分量表(The Unified Parkinson's Disease Rating Scale,UPDRS)和Hoehn-Yahr分级量表是PD临床诊断和评估治疗的常用方法。根据英国脑库的帕金森病诊断标准,患者有少动,再加上静止性震颤、肌强直、姿势步态异常三种症状中的一种,即可诊断为PD。但是由于发病机制的复杂性,不同患者的临床症状、体征可能有所不同,而且同一患者在不同时间的病情也会有变化,且评定结果常常受患者及医生的主、客观因素的影响,使得结果缺乏可比性,给临床诊断带来困难。因此,筛选出PD相关的生物标记物对于揭示其发病机制并开发出客观的诊断方法,进而达到疾病预防、控制和治疗的目的具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是长度为19-23个核苷酸的内源性单链短序列非蛋白编码RNAs,与宿主基因共转录,参与了大约1/3基因的表达,广泛存在于真核生物中,是调节其他功能基因表达的重要调控分子,并参与多种细胞过程的调节,例如生成、分化、细胞增殖和细胞凋亡,其异常调节导致多种疾病的发病,包括癌症和神经变性疾病。在成熟的和非成熟的大脑中,在不同脑区和不同细胞种类中,miRNAs的表达水平非常高,某些miRNA出现在细胞内如突触,树突和轴突等特定位置。它们能够提高细胞的内稳态,调节应激反应,调整很多与突触可塑性相关的参数。相比于蛋白质,miRNA是一种更容易穿过血脑、胎盘等屏障,以及存在于体液中的小分子。目前已经在胞浆、血清、尿液、唾液和乳汁中检测到脱落细胞的miRNA,这些miRNA受外切体和其他微粒的膜、蛋白质、液体等分子的保护。由于凋亡小体的出现、微泡的出芽和脱落、高密度脂蛋白质的主动分泌等过程导致miRNA向细胞外释放,随后由于细胞死亡,miRNA出现在体液中所有形式的脱落细胞中。miRNA在血液和其他体液中呈高度稳定性。miRNA的分泌具有选择性,可以因不同的病理过程发生明显改变。其易于检测的特点,提示了其作为疾病诊断标志物的广泛前景。研究表明PD是一种脑部病变疾病,因此脑组织是反映该疾病本质最好的组织样本。然而,由于脑组织的特殊性,同时PD至今没有十分明确的致病脑区,只能尸检取脑组织作为研究对象,使得脑组织的相关生物标记物很难在实际临床诊断中得以应用。众所周知,脑脊液与脑组织每时每刻都在进行着分子交换,能及时、较为准确、动态地反映脑组织的一些变化。在PD的生物标记物的研究中,很多学者以脑脊液为生物样本,但是由于采用腰椎穿刺的方法取脑脊液存在着患者被感染和出血等风险,较难被病人接受。由于miRNAs在血液血浆或血清中稳定存在,使用当今敏感的分析方法,可在低浓度时可靠地检测到,因此,研究血清miRNA是一种无创的早期诊断和预后评价的良好样本。目的筛选出PD患者血清特异性miRNA表达谱,并对筛选出的miRNA进行验证,初步判断其在PD发病中的可能作用。为寻找PD的血清miRNA的生物标记物提供依据,评价其对PD的诊断价值。方法1.样本采集:根据英国PD脑库诊断标准,并且根据统一帕金森病评分量表的标准(UPDRS)和改良的HoehnYahr分级法以及磁共振成像和神经心理学测试给予诊断选出138例帕金森患者。选择年龄、性别匹配的正常志愿者112例为对照组。2.Solexa测序:运用Solexa测序技术检测12例PD患者以及12例健康对照组组成的混合血清中miRNA的表达量,初步筛选出PD组与健康对照组表达有显著差异的miRNAs。3.验证:运用实时荧光定量PCR(quantitive realtime PCR,qRT-PCR)技术验证PD组138例和健康对照组112例初筛的miRNAs。4.进一步验证:运用实时荧光定量PCR进一步验证复筛得到的PD患者中有显著差异的miRNAs,最后通过Spearman秩相关分析以及ROC曲线评价其临床诊断价值。结果1.Solexa测序结果:Solexa测序筛选出16种miRNAs,PD组与健康对照组表达有显著差异,分别为 miR-141,miR-146a-5p,miR-193a-3p,miR-214,miR-133b,miR-15b,miR-181a,miR-185,miR-195,miR-221,miR-29c,miR-29a,miR-19b,miR-24,miR-34b,miR-148b。2.验证:运用实时荧光定量PCR对16种miRNAs进行验证,发现4种miRNAs在PD患者血清中的表达与健康人血清有显著差异,分别是miR-29c,miR-146a,miR-214 和 miR-221。3.进一步验证:运用实时荧光定量PCR对这4种miRNAs进行进一步验证。结果显示PD患者血清中miR-29c,miR-146a,miR-214和miR-221的表达较健康人均下调。(1)经过秩检验发现,miR-221检测结果与UPDRS-Ⅲ量表得分的相关系数为0.4702,其P值小于0.0001;同时,还发现其与UPDRS-V量表得分的相关系数为 0.4788,P 值小于 0.0001。miR-221 基因与 UPDRS-Ⅲ和 UPDRS-Ⅴ量表评分有正相关性,并且都有统计学意义。(2)经过秩检验发现,miR-29c,miR-146a,miR-214检测结果与UPDRS-Ⅲ量表得分的相关系数分别为0.1218,0.1669,0.1931,其p值均大于0.05;同时,还发现其与UPDRS-Ⅴ量表得分的相关系数分别为0.3333,0.1394,0.5476,p值均大于0.05。所以miR-29c,miR-146a,miR-214对于PD的预测效应均尚不具备科学意义。(3)我们也验证了 4 中 miRNA 的 ROC 曲线(Receiver Operating Characteristic Curve)下面积,其中miR-221的曲线下面积最大为0.8639± 0.00223,而且具有统计学意义,其他三种结果如下,miR-29c的曲线下面积为0.7565± 0.0333,miR-146a的曲线下面积为0.5752± 0.0373,miR-214的曲线下面积为0.8240± 0.0288。结论PD患者和健康人血清中存在着丰富而且稳定的各种miRNAs,患者血清miRNA的表达谱与健康人之间存在显著差异,我们的研究结果显示miR-29c,miR-146a,miR-214和miR-221在PD患者血清中的表达较健康人显著下调,然而,miR-221基因与UPDRS-Ⅲ和UPDRS-Ⅴ量表评分有正相关性,且ROC曲线下面积具有统计学意义。血清miR-221可能成为诊断PD潜在的生物标记物。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

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