香芹酚对巨噬细胞泡沫化的影响及其在RASMCs中的自噬机制研究

发布时间：2018-10-17 10:18

【摘要】：1.研究目的和意义动脉粥样硬化是一种进行性疾病,其特征是脂类的积累和大动脉血管纤维元素。慢性炎症在动脉粥样硬化的发展起着重要的作用。激活的白细胞、内皮细胞和巨噬细胞产生促炎细胞因子包括IL-1β,IL-6、以及TNF-α以及抗炎细胞因子,如IL-10。从中草药、植物中寻找有效且毒副作用反应小的抗动脉粥样硬化的药物靶点,可成为新世纪国内外学者研发抗血脂药物的新方向。已证实香芹酚具有多方面的药理特性且对人体正常细胞毒性最小。已有多项实验研究表明香芹酚具有抗炎、抗动脉粥样硬化内膜增生的作用。但具体的作用机制尚未清楚。本研究探索香芹酚对(ox-LDL)诱导细胞自噬的影响,并初步探讨其可能的分子机制。2、方法1、体外培养氧化低密度脂蛋白诱导的TPH-1细胞成泡沫细胞,然后用不同浓度的香芹酚(终末浓度为0.1、1.0、5.0、10uM)处理巨噬细胞RAW246.7细胞24 h,检测随着香芹酚的浓度的增加观察其抗增殖效应和诱导凋亡效应。THP-1细胞采用PRMI-1640培养基和10%无支原体新生小牛血清作为补充培养液,置于37 'C、5%C02的细胞培养箱中。取对数生长期细胞进行实验,实验前用100nM佛波醋(PMA)培育THP-1细胞24h,使其诱导分化成巨噬细胞,更换培养基后加不同浓度梯度的Ox-LDL继续培养48h,使其转化成泡沫细胞。2、观察香芹酚对氧化低密度脂蛋白诱导的TPH-1细胞成泡沫细胞的凋亡作用.Hoechst33258染色法检测RAW246.7细胞增殖凋亡。分别使用P38-MAPK信号通路特异性阻抗剂SB203580阻断P38-MAPK信号通路和ERK/MAPK信号通路特异性阻断剂U0216阻断ERK/MAPK信号通路,检测细胞的活性和表达关系。实验分组如下:(1)、香芹酚作用组:分别以不同组分香芹酚作用RAW264.7细胞24,48h,设空白对照组和药物组,观察香芹酚对RAW264.7细胞炎症定性率及稳定性蛋白的影响;通过Western Blot在RAW264.7细胞中15分钟检测香芹酚对磷酸化蛋白质及其总蛋白表达的MAPK信号通路的影响。(2)、抑制剂组:分别以20MU0126A(ERKl/2特异性抑制剂)及10M SB203580B(P38特异性抑制剂)作用RAW264.7细胞48,24h,空白对照是以相应条件下不加抑制剂的RAW264.7细胞,观察其对RAW264.7细胞炎症及斑块稳定性形态的影响。(3)、香芹酚和抑制剂联合组:为观察特异性抑制MAPK信号转导通路对香芹酚抑制RAW264.7细胞炎症影响。用5uM香芹酚,10MU0126及10MSB203580联合作用于RAW264.7细胞24h,抑制剂提前于香芹酚1h加入。3、通过油红0染色显示细胞内脂滴的状态,检测香芹酚抑制泡沫细胞形成细胞接种于培养板内,oxldl诱导建模成功后,检测不同香芹酚浓度抑制泡沫细胞水平。4、观察香芹酚是否抑制ox-LDL诱导的LOX-1表达取细胞的总RNA进行RT-PCR,检测不同浓度Carvacrol组LOX-1蛋白水平。5、Western Blot法分析香芹酚对氧化低密度脂蛋白诱导的TPH-1细胞成泡沫细胞泡沫化中凋亡及NFkB蛋白的各种磷酸化形式Western Blot法包括1、灌胶与上样2、电泳3、转膜4、封闭5、免疫反应6、观察香芹酚抑制Ox-LDL诱导的炎症因子分别以香芹酚1uM,5uM,10uM三个浓度梯度的Carvacrol处理Ox-LDL作用下THP-1巨噬细胞48小时后,用ELISA法检测细胞培养上清液中的TNF-a、IL6、IL-1beta。7、观察香芹酚对氧化低密度脂蛋白诱导的细胞自噬的影响。通过电镜检测及WesternBlot检测其香芹酚对氧化低密度脂蛋白诱导的TPH-1细胞成泡沫细胞泡沫化和大鼠RAVSMCs的自噬变化。(1)选取SD大鼠最好150-180g,组织培养血管分为空白对照组(只含1%双抗的无血清的DMEM培基)、香芹酚干预组(MCP1终浓度为1OOng/ml)。同时留取部分新鲜血管环于液氮中冻存。WesternBlot检测其香芹酚对自噬相关蛋白mTOR、p62、LC3Ⅱ和LAMP-2蛋白的表达水平。3、结果1、MTT检测用不同浓度的香芹酚(终末浓度为0.1、1.0、5.0、10 uM)处理巨噬细胞RAW246.7细胞24h后香芹酚的浓度的增加其增殖活性未见明显变化,与空白对照组相比较,组间比较差异无统计学意义显著(P0.05);用香芹酚(终末浓度为0.1、1.0、5.0、10mM)处理oxldl刺激后24 h,随着香芹酚的浓度的增加其增殖活性未见明显变化,组间比较差异无统计学意义显著(P0.05)2、香芹酚在体外实验中对巨噬细胞系RAW246.7细胞的泡沫化具有明显的抑制作用Hoechst33258核染色分析显示经不同浓度的香芹酚处理后的RAW246.7细胞24小时后均呈现出明显的凋亡特征,随着浓度的增加,细胞数量逐渐减少,呈现浓缩致密的固缩形态或颗粒状态的凋亡细胞数增加,明显的细胞碎片形成。核染色的结果显示:阻断ERKMAPK信号转导通路后,并没改变RAW246.7细胞凋亡情况,而阻断p38MAPK信号转导通路后RAW246.7细胞凋亡明显减少。3、香芹酚抑制泡沫细胞脂滴含量:通过显微镜观察,control组胞浆中红色脂迪数量很少,胞浆中只有可见数颗脂滴。ox-LDL处理组细胞胞浆中有大量红色脂滴,红色脂滴约占细胞体积的50%以上。与control组相比,经香芹酚(CAR)孵育后,胞内脂滴含量较ox-ldl处理组组胞内脂滴逐渐减少,并随着浓度的增加胞内脂滴数目减少。4、香芹酚抑制ox-LDL诱导的LOX-1表达;与control组相比,不同浓度Carvacrol组LOX-Ⅰ蛋白水平明显降低,有统计学意义(P0.05)。且浓度越高,Lox-Ⅰ蛋白水平越低。Carvacrol组LOX-Ⅰ蛋白水平与ox-LDL组相比差异显著,具有统计学意义(p0.05)。但Carvacrol 1uM组与ox-LDL组相比,无统计学意义(p0.05)。5、香芹酚抑制ox-LDL诱导泡沫细胞炎症因子表达:Ox-LDL刺激细胞后,细胞上清液中的TNF-a、IL6、IL-1 beta,与对照组相比有显著统计学意义(P0.05vs control)。而Carvacrol处理后随着浓度的增加,炎症因子TNF-a、IL6、IL-1beta相对下降,均与对照组相比有显著统计学意义(p0.05 vs oxldl组)6、香芹酚抑制泡沫细胞LPS诱导的炎症细胞因子的表达RAW246.7经LPS组处理后TNF-a,IL-1beta、IL-6水平显著高于其他组别,CAR处理后能抑制LPS诱导的TNF-a的增加(p0.01)如图LPS组处理后TNF-a,IL-beta、IL-6水平显著高于其他组别,CAR处理后能抑制LPS诱导的TNF-a的增加(p0.01)。7、香芹酚影响对经ox-LDL诱导的单核-巨噬细胞自噬相关蛋白mTOR、p62表达与control组相比,ox-ldl处理组组中mTOR蛋白表达水平显著增加(P0.05)水平。与ox-ldl组相比,三个剂量香芹酚干预均可使mTOR蛋白表达进一步下降,其中10uMCAR组显著低于ox-ldl组的。各组的p62蛋白表达趋势与mTOR基本一致。与ox-Idl组相比,ox-ldl +中剂量组和ox-ldl +香芹酚高剂量组组的p62蛋白表达分别下降,且均具有统计学意义(P0.05),ox-ldl组LC3 Ⅱ蛋白表达低于control组,但无统计学差异。和ox-ldl组相比,香芹酚可上调LC-3Ⅱ蛋白表达,其中ox-ldl+中剂量组LC3Ⅱ表达上调,ox-ldl+香芹酚高剂量组上调,且均具有统计学意义(P0.05)。4.结论(1).香芹酚在体外实验中对巨噬细胞系RAW246.7细胞的泡沫化具有明显的抑制作用;香芹酚调节泡沫细胞凋亡可能与p38MAPK信号转导通路相关;(2).香芹酚抑制泡沫细胞脂滴含量;(3).香芹酚抑制ox-LDL诱导的LOX-1表达;(4).香芹酚抑制ox-LDL诱导泡沫细胞炎症因子表达;(5).香芹酚抑制ox-LDL对NF-κB的激活;(6).香芹酚抑制泡沫细胞LPS诱导的炎症细胞因子的表达;(7).香芹酚可降低主动脉平滑肌细胞mTOR、p62和LAMP-2的表达,.香芹酚影响对经ox-LDL诱导的单核-巨噬细胞自噬相关蛋白mTOR、p62 表达。综上所述,香芹酚(CAR)可能通过调节巨噬细胞凋亡增殖,抑制炎症的方式减少泡沫细胞形成,以及调节自噬-溶酶体代谢LC3,从而发挥动脉粥样硬化的保护作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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