MAPK家族在成骨细胞分化过程中调控作用的研究

发布时间：2017-01-01 00:06

  本文关键词：MAPK家族在成骨细胞分化过程中调控作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《兰州大学》 2015年

MAPK家族在成骨细胞分化过程中调控作用的研究

赵良功  

【摘要】：目的：随着老龄化社会的到来,骨质疏松成为世界广泛关注的健康问题之一,是绝经后女性和老年人的常见病。针对骨质疏松合理的治疗方案包含药物治疗与运动治疗相结合。但由于应力在成骨过程中作用机制不甚明确,临床医生很难指导患者进行正确地运动治疗。同时,现有药物在治疗骨质疏松的同时还存在增加乳腺癌和子宫内膜癌等患病率的副作用。探索并发现促成骨效率高而副作用小或无副作用的骨质疏松治疗药物非常重要。本论文通过分别研究MAPK家族成员ERK5在流体剪切力促进成骨细胞分化及p38 MAPK在红芪多糖促进成骨过程中不同的调控作用,为临床正确指导患者进行合理运动及成骨减少性疾病治疗药物的开发提供了理论依据。方法：第一部分：对MC3T3-E1成骨细胞加载间歇流体剪切力或间歇性流体剪切力,应用MEK5/ERK5特异性阻断剂BIX02189抑制ERK5的活性,研究比较两种流体剪切力对成骨细胞分化促进作用的强弱以及ERK5在间歇性流体剪切力促进成骨细胞分化过程中的调控作用；第二部分：水提醇沉淀法从中药材红芪中分离得到不同分子量范围的红芪多糖(HPS),进一步纯化得到HPS3d。通过对成骨细胞给予不同浓度HPS3d刺激72小时,并且应用p38 MAPK特异性阻断剂SB203580抑制p38的活性,通过MTT、RT-PCR和Westernblot等方法研究HPS3d促进成骨细胞分化和P38 MAPK对上述过程的调控作用。结果：第一部分：(1)同对照组相比,持续性与间歇性流体剪切力均可以促进ERK5的磷酸化,增强ALP的活性,促进OCN及OPN的蛋白表达。进一步比较发现,加载间歇性流体剪切力的成骨细胞中,ERK5磷酸化水平、ALP的活性OCN、 OPN的蛋白表达量均明显高于加载持续性流体剪切力的成骨细胞。(2)加载间歇性流体剪切力后,成骨细胞中ERK5的磷酸化水平较正常组明显升高,而应用10μM的MEK5/ERK5阻断剂BIX02189孵育2小时后,MEK5/ERK5的活性完全受到抑制。同对照组相比,间歇性流体剪切力可以增强成骨细胞中ALP的活性,增加OPN、OCN和Runx-2的表达。但抑制MEK5/ERK5的活性后,这种促进作用也相应的受到减弱。同时,单独应用BIX02189对ALP的活性,OPN, OCN和Runx-2的表达无明显影响(p0.05)。第二部分：(1)通过对红芪药材进行提取、分离和纯化,从中获得了组成均一的红芪多糖HPS3d。经过分析发现,HPS3d中多糖含量为94.35%,蛋白质含量为3.4%,糖醛酸含量为13.3%,HPS3d为酸性糖蛋白复合物。元素分析结果O为53.91%,C为38.18%,H为5.66%,S为1.73%,N为0.52%。HPS3d的分子量范围为84.6kDa,空间分子构象为高枝化度结构。结构中含有鼠李糖(5.93%)、阿拉伯糖(39.95%)、葡萄糖(6.76%)、半乳糖(39.95%)及半乳糖醛酸(8.05%)。HPS3d的支链主要由阿拉伯糖构成,而主链由半乳糖与半乳糖醛酸构成。(2)成骨细胞分别经过浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、 8.0mg/ml、16.0mg/ml及32mg/ml的HPS3d刺激72h后,用MTT法检测细胞活性。结果可见,当HPS3d浓度为0.5-8.0mg/ml时,细胞活性同对照组相比无显著性差异(P0.05)。(3)成骨细胞分别经过浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml的HPS3d刺激72h后发现,当HPS3d浓度为0.5mg/ml时,ALP活性,OPN、OCN和BSP的]mnRNA表达未受到明显影响。当HPS3d浓度为1.0mg/ml、 2.0mg/ml和4.0mg/ml时,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表达呈浓度依赖性升高。并且当HPS3d浓度为8.0mg/ml时,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表达同4.0mg/ml组比较不再继续升高(P0.05)。(4)用浓度为0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨细胞胞72h后,Runx-2和Osterix的mRNA表达量自HPS3d浓度为1.0mg/ml时开始呈剂量依赖性升高,并在4.0mg/ml时达到最高,同对照组相比,分别升高了5.2倍和6.6倍。进一步用浓度为2.0mg/ml和4.0mg/mlHPS3d刺激成骨细胞72小时后,Western blot检测Runx-2和Osterix蛋白表达量均明显升高。(5)用浓度为0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨细胞胞72h后,BMP-2的mRNA表达量自HPS3d浓度为1.0mg/ml时开始呈剂量依赖性升高,并在4.0mg/ml时达到最高。进一步用浓度为2.0mg/mI和4.0mg/mIHPS3d刺激成骨细胞72小时后,Western blot检测发现SMAD1/5/8的磷酸化水平较对照组升高。(6)用p38特异性阻断剂SB203580预处理成骨细胞后再经过4.0mg/ml HPS3d刺激72小时后,同对照组相比,经HPS3d单独刺激的成骨细胞中p38MAPK的磷酸化水平升高。p38 MAPK的特异性阻断剂可以抑制上述HPS3d介导的p38 MAPK磷酸化。而HPS3d促进的ALP活性增强、OCN、OPN、BSP、 Runx-2和Osterix的mRNA表达升高在用SB203580后均受到不同程度的抑制。结论1、强度为12dyn/cm2的持续性与间歇性流体剪切力均可以促进MC3T3-E1成骨细胞ERK5的磷酸化,增强ALP的活性,促进OCN及OPN的蛋白表达。进而促进成骨细胞分化。同持续性流体剪切相比,间歇性流体剪切力是一种更为有效的成骨细胞分化促进应力形式。2、抑制MEK5/ERK5的活性后,间歇性流体剪切力促进的成骨细胞中ALP的活性与OPN、OCN表达增加均受到抑制。MEK5/ERK5对流体剪切力促进成骨细胞分化具有调控作用。而成骨细胞分化关键性调控因子Runx-2的表达同时降低,说明除了ERKl/2与p38外,Runx-2的表达还受到MEK5/ERK5的调控。3、最终获得的红芪多糖的主要部分HPS3d为白色絮状物,极易溶于水,为酸性糖蛋白复合物。元素含量O为53.91%,C为38.18%,H为5.66%,S为1.73%,N为0.52%。分子量范围为84.6kDa,分子结构为高枝化度；支链主要由阿拉伯糖构成,而主链由半乳糖与半乳糖醛酸构成。4、适当浓度的HPS3d可以促进ALP活性,使OPN、OCN和BSP的mRNA表达并且呈浓度依赖性升高,进而促进成骨细胞分化；同时HPS3d使BMP-2、SMAD1/5/8、Runx-2和Osterix蛋白和mRNA的表达均升高。说明在HPS3d促进成骨细胞分化的过程中BMP-2/SMAD/Runx-2/Osterix信号通路被激活。同时中低浓度HPS3d对细胞无明显毒性作用。5、HPS3d还可以激活p38 MAPK,在p38的活性受到特异性阻断剂的抑制后,成骨细胞分化相关的多种蛋白表达及Runx-2和Osteri的表达均明显受到抑制,说明p38 MAPK通过Runx-2/Osterix发挥调控HPS3d促进成骨细胞分化的作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

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本文编号：230325