白果复合毒性物质基础及其减毒机制研究

发布时间：2018-11-03 17:55

【摘要】：白果为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥成熟种子。长期以来作为药食同源之品,但历代本草都有"白果有毒"的记载,在长期的实践中已证实大量食用白果后会产生剧烈的毒性反应,甚至危及生命。然而,白果毒性物质基础不够明确、致毒机理不甚清晰,导致其安全食用受到限制,也制约了我国这一宝贵食药两用资源的价值体现和产业化发展。鉴于此,本论文以白果多元毒性物质的分析评价为基础,开展了主要毒性成分银杏酸及吡哆醇的毒性表征及体内过程研究,并进一步通过对白果加工工艺的考察及优化,对白果加工过程中的减毒方法及机制进行了研究,为安全食用白果的产业化开发,提供科学依据。本论文研究工作为国家科技支撑计划项目"银杏叶系列产品质量标准提升及银杏资源综合开发利用"(2011BAI04B03)的后续研究工作;国家自然科学基金项目"基于构-量-毒关系的白果复合毒性物质基础及其致毒机理研究"(81673532)的部分研究内容。一、文献研究通过对白果相关文献的梳理和归纳,总结目前白果毒性研究的现状及毒性中药的研究方法,以期用现代的毒性研究方法,对白果毒性物质基础及体内过程的研究提供科学参考。二、实验研究(一)白果多元毒性物质的分析评价通过建立相应的检测方法,对白果中的主要毒性物质银杏酸类、吡哆醇类及氰类化合物进行定性定量分析。采用对照提取物法对白果中银杏酸类成分进行测定,结果表明,白果中 GAs 含量 GA(15:1)461.86μg/g～922.35μg/g,GA(17:2)86.68μg/g～227.75μg/g,GA(17:1)81.67μg/g～279.75μg/g;对白果中的MPN进行测定,结果表明MPN含量在256.38μg/g～373 μg/g。采用苦味酸试纸法对白果中氰化物进行分析,结果表明,白果中氰化物含量低于检测限,呈阴性反应。结论,氰化物不是引起白果急性中毒的毒性物质,且不同批次间,GAs及MPN含量差距较大。所建方法可靠易行,适用于白果毒性成分的评价分析。(二)基于体内过程的白果毒性物质作用特征及复合毒性研究1.银杏酸类物质毒性表征及体内过程研究采用斑马鱼毒性实验及小鼠LD50急性毒性实验对GAs进行急性毒性评价,判断毒性剂量,描述中毒症状。结果显示:GAs致斑马鱼中毒呈给药时间和浓度依赖性,毒性反应较慢,无急性毒性症状;小鼠口服GAs后,并未出现急性中毒症状,死亡集中发生于给药后3～4天,LD50为7.89g/kg,95%的置信区间为(7.19～8.68)g/kg,处于低毒级别。开展了大鼠口服GAs的药动学、组织分布及代谢组学等研究;GAs及其代谢物药动学参数大鼠灌胃给药后,高(900 mg/kg)、中(300 mg/kg)、低(100 mg/kg)三个剂量组C-T曲线均出现双峰现象;GAs代谢物的药动学研究中,选择了定性可靠且峰面积可有效测定的6个代谢物。绘制相对变化曲线进行药动学研究。6个代谢物为GA(15:1)和GA(17:1)的羟基化产物、羰基化同时羟基化产物(双重氧化产物)以及葡萄糖醛酸化产物,高剂量给药组的代谢物生成量明显少于中、低剂量组,各代谢物的达峰所需时间,较原型化合物均存在滞后现象。GAs组织分布大鼠口服GAs后,迅速分布于主要脏器中,且主要蓄积于肝脏。0.5 h时肝脏中分布最多,随后逐渐减少。脑中含量逐渐升高至4 h时含量最多,随后逐渐下降。5种GAs的组织分布情况大致相同。GAs排泄大鼠以900 mg/kg的剂量灌胃给药GAs后,主要从粪便排出体外,粪便排泄率为29.6%,尿液排泄率为0.004%,胆汁排泄率为3.54%。5个GAs在各排泄物中的排泄趋势一致,尿液的排泄主要集中在6～12 h,粪便的排泄主要集中在12～48 h,24 h内胆汁的排泄比较均匀。各个化合物在排泄物中的排泄比例与给药GAs中的比例类似,各个银杏酸大鼠排泄过程没有显著差异。口服GAs血清代谢组学大鼠口服GAs之后,血清中BUN和CRE显著增高,TP和ALB显著降低,提示GAs对肝肾功能存在一定的损伤。血清中相关的酶ALT、AST、LDH以及CK的活力显著降低,可能与GAs对体内酶活的抑制作用有关。主成分分析(PCA)图中,不同分组的样品之间具有显著差异,口服GAs后第3天的样本距离空白组样本最远,提示第3天时大鼠体内的内源性成分产生了显著的变化,在第7天时机体内源性物质逐渐回归正常水平,提示机体存在自我恢复的能力。这一结果与小鼠口服银杏酸的LD50实验结果相符;初步定性的14个关键生物潜在标志物,主要包括不同类型的LysoPC和LysoPE。这些生物标志物主要集中在鞘脂类代谢、甘油磷脂代谢及原发性胆汁酸的生物合成通路中,提示GAs毒性可能作用于这些代谢通路而引起毒性反应。2.吡哆醇类物质毒性表征及体内过程研究采用斑马鱼毒性实验及小鼠LD50急性毒性实验对MPN进行急性毒性评价,判断毒性剂量,描述中毒症状。结果显示,MPN可对斑马鱼幼鱼有神经毒性的影响,且对斑马鱼脏器形态,胚胎孵化具有一定影响;小鼠口服MPN出现抽搐惊厥等急性毒性症状。中毒剂量与死亡剂量相近,LD50为35.20 mg/kg,95%的置信区间为(33.18～37.33)mg/kg。MPN中毒后的毒性表现与白果中毒症状相符,提示MPN是引起白果急性中毒的主要毒性物质。开展了 MPN及其相关吡哆醇类化合物的药动学、组织分布、代谢组学研究;MPN药动学参数大鼠口服MPN后,血浆中的吡哆酸(4-PA)、吡哆醇(PN)与吡哆醛(PL)的血药浓度均有上升,这一结果说明4-PA、PL和PL可能是MPN 口服后的代谢产物。另一方面,也可能是由于MPN较维生素B6更易与磷酸激酶PKH反应,以此抑制了 PL的磷酸化,从而导致体内PL含量的升高。而4-PA是PL的氧化产物,并作为维生素B6的末端代谢产物最终由肾脏排出。MPN作为维生素B6的衍生化合物,可能也存在这一代谢过程。MPN组织分布大鼠口服MPN后,在组织中迅速分布,5 min即达到最大分布量,之后逐渐减少。各主要脏器中均有分布,肝脏中的分布蓄积量较大。24 h时各组织样品中MPN含量已降至较低水平。4-PA在心、肝、脾、肺、肾中均有一定分布,在脑组织中未能检测到。各时间点组织样品中,肝脏与肾脏中4-PA含量较高,心脏样品中可测的4-PA含量较低,15 min之内肺与脾脏样品中4-PA含量较低,4-PA大部分分布于肝、肾组织中,0.5 h～1 h之间肺与脾脏中的4-PA含量升高,4h时大幅度降低。24 h时各组织样品中均能检测到4-PA,且大部分分布于肝脏与肾脏之中。这可能与其在肝脏内被代谢并最终经肾脏排泄有关。MPN-5'-glucoside药动学研究大鼠口服 MPN-5'-glucoside 后,血浆中 MPN-5'-glucoside含量迅速升高,并在4 h之内快速下降,血浆中迅速代谢生成MPN,并在4 h之内快速下降至难以测得。血浆中4-PA、PL以及PN浓度均同步升高,代谢趋势相似。提示,MPN-5'-glucoside进入体内后代谢生成MPN,进一步引起4-PA、PL以及PN的变化。口服MPN代谢组学研究大鼠口服MPN后,24 h之内进行血清代谢组学研究,所测13个生化指标,结果表明,口服MPN后血清中的TBIL、LDH、BUN、CRE、BUN和CRE水平均有显著变化。5 min之后血清中BUN和CRE水平相比空白组,产生了明显的下降,24 h时仍与空白组存在显著差异。TBIL水平显著下降,LDH的活力在给药后显著增高,随后在整个实验过程中逐渐下降,至24 h时恢复至与空白组相近的水平。3.白果主要毒性物质复合毒性表征GAs对MPN大鼠药动学的影响大鼠同时给予GAs与MPN后,MPN的AUC(0-t)显著降低,血浆中4-PA的AUC(0-t)与MPN的AUC(0-t)存在相似比例的下降,PN的AUC(0-t)存在小幅度上升现象,而PL的AUC(0-t)与单独给予MPN时相近,显示GAs对MPN的体内过程存在显著影响。同时给予GAs后,MPN、4-PA、PN以及PL的Tmax与单独口服MPN相比均存在延迟现象,这可能与GAs对MPN的吸收或对体内酶活存在抑制作用有关,从而延迟了 MPN及其代谢物的达峰时间,并降低MPN的Cmax。MPN对GAs大鼠药动学参数的影响单独给予GAs时,药时曲线存在双峰现象;大鼠同时给予GAs与MPN后,GAs并无明显的双峰现象,GA(13:0)的AUC(0-t)较单独给予GAs时增大,其余四种GAs的AUC(0-t)均有小幅度的减小。GA(13:0)与 GA(15:1)的 Cmax增大,而 GA(17:2)、GA(15:0)与GA(17:1)的Cmax均少许降低;血浆中的GAs代谢物含量发生了明显的变化,其中羟基化产物明显降低,而葡萄糖醛酸化产物含量升高。MPN与GAs合并口服后,对GAs的体内过程存在影响。此影响可能与银杏酸的脂肪链长度存在一定关系。吡哆醇类化合物复合毒性研究同时给予MPN后,并未显著影响MPN-5,-glucoside的药动学参数,但血浆中4-PA、PL与PN上升幅度均比单独口服MPN-5'-glucoside时更大。MPN-5'-glucoside 口服后在体内代谢生成MPN,进一步生成4-PA、PL与PN等代谢产物。(三)白果减毒方法优化及机制研究在可食部位中,胚芽是含毒性成分最高的部位,其重量占可食部位总重量的2.82%,但含有的GAs却占可食部位中GAs的62.1%,含有的MPN占3.87%。提示,去除白果中的胚芽,可有效地降低白果可食用部位的毒性。加工温度与干燥速度是影响白果中毒性物质含量的主要影响因素。50℃以下加工,白果中GAs与MPN含量变化较小。50℃及更高温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃),同时保持白果湿度条件下,白果中MPN损失率达90%以上,但高温快速干燥过程中,白果中MPN含量几乎不变。GAs在高温(90℃、100℃)处理后的白果中含量减少约55%。结果提示,MPN的含量变化可能与自身含有酶的转化有关,温度过低酶活力不够,快速干燥过程中白果中水分迅速流失,在水分少的条件下酶活力下降,MPN的减少亦非常有限。比较白果样品处理前后的色谱图,保湿保温60℃放置12h后,白果样品中的MPN峰显著降低至难以辨认,同时色谱图中另外三个峰明显增高。温度越高白果中MPN转化速率越快,且存在平衡点。三个转化产物在加热开始时,随加工的时间增加而增加,温度越高转化产物增长越多,速率越快。提示白果中各成分在加热过程中存在一定的平衡状态,最终达到稳定的状态。经过对照品比对,其中一个转化产物确定为4'-O-甲基吡哆醇-5'-葡萄糖(MPN-5'-glucoside)。推测这是MPN在白果自身含有的葡萄糖苷酶作用下的生物转化产物。采用模式生物斑马鱼比较MPN与MPN-5'-glucoside的毒性,结果显示MPN-5'-glucoside的毒性明显小于MPN。在以上研究的基础上,制定了基于酶促方法解除白果毒性的方法,并进行了工艺验证。确定的工艺为:新鲜白果采用控温控湿设备或在控湿条件下以其它加热设备控制温度60℃条件下,使其含水量保持50%以上,维持7小时,之后加热至90℃～100℃,进行加热干燥至需要的含量,并再继续保持温度1小时。生产的低毒白果可作为各类白果产品开发的原料。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.1
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本文编号：2308523