【摘要】：目的:本课题旨在观察无髓性损伤的慢性颈脊髓压迫人群的颈肩部疼痛、颈椎活动受限、颈椎不稳、颈脊髓受压比例、颈椎JOA评分,探究该类人群上述临床表现特点,分析可能影响无髓性损伤的慢性颈脊髓压迫人群预后的危险因素。改善该类人群的治疗效果。建立并初步验证无髓性损伤的慢性颈脊髓压迫大鼠模型。基于NF-kappa B信号通路,观察颈脊髓在慢性轻度压迫下是否存在炎性反应,并以补肾活血方干预这种炎性反应,为进一步研究慢性颈脊髓压迫病机及治疗提供实验基础。方法:1.临床观察收集2013年5月-2014年10月在广东省中医院门诊符合纳入标准的患者85例,完成随访68例,末次随访为2017年2月。根据颈椎JOA评分在纳入时和末次随访之间的差值,将患者分为(0-]分)低分组和(≥2分)高分组。观察入组时核磁影像矢状面脊髓压迫比例、颈肩或上臂部疼痛部位(颈后部、枕部、肩部、肩胛区内侧缘、上臂)、颈肩部疼痛性质(酸痛、胀痛、刺痛)、疼痛程度、肌肉紧张感、颈椎活动受限、颈椎不稳等分布情况是否存在组间差别。2.实验室研究:无髓性损伤的慢性颈脊髓压迫大鼠模型验证研究方面,将30只300g-350g Sprague Dawley(SD)雄性大鼠随机分为2组,对照组(即假手术组)和模型组,观察大鼠行为学评分(Basso Beattie Bresnahan scores,BBB评分)以了解大鼠神经功能并剔除神经功能受损大鼠(BBB评分19分,满分21分)。苏木精-伊红染色(HE染色)观察脊髓形状结构变化。造模1周和1月时用核磁共振明确压迫部位、压迫程度及局部是否存在炎性病变,造模后1月取材。炎症机制探讨研究,将SD雄性大鼠随机分为对照组(假手术)和模型组,每组20只。造模后1月取材。补肾活血方干预和NF-kappa B信号通路调节炎症研究方面,将大鼠分为药物组(补肾活血方灌胃)、抑制剂组(吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)腹腔注射)、药物+抑制剂组(补肾活血方灌胃+PDTC腹腔注射)、模型组,每组20只,中药(补肾活血方:丹参15g,淫羊藿15g,仙茅15g,附子10g)于造模后第二天给予,PDTC造模前4小时给予,随后都每日给予,1月后取材。造模1月后取出受压脊髓,用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测脊髓中p65、TNF-α、IL-1 β、IL-6的mRNA表达量,蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测磷酸化-p65(pp65)、TNF-α蛋白表达量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6、IL-lβ蛋白表达量,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)标记神经细胞(Neun标记)、活化小胶质细胞(CD68标记)、NF-kappa B活化细胞(p65标记)并且计数。HE染色切片观察脊髓神经细胞形态。持续评估(BBB评分)大鼠神经功能并髓性损伤大鼠(19分)。中药复方指纹图谱及色谱分析补肾活血方的主要成分。结果:临床观察结果表明高分组患者中刺痛及颈椎不稳的出现频率较低分组更高,而低分组中伴胀痛的患者更多。(P0.05)颈椎不稳可能与颈椎JOA评分下降幅度有关(-0.264),(P0.05)两组间其他指标在两组间均无统计学差异。与对照组相比,慢性颈脊髓轻度受压大鼠神经功能BBB评分在造模后1月内没有差异。(P0.05)造模后1周和1月时,核磁共振证明模型鼠的颈脊髓存在轻度压迫,脊髓周围没有水肿信号,排除周围组织炎性水肿波及脊髓的情况,植入物位置固定,大小相似。造模后1周和1月时,HE染色表明模型鼠的颈脊髓受到轻度压迫,但两组脊髓内神经细胞和胶质细胞分布均匀,胞体饱满,细胞核和细胞质界限分明。提示造模后1月内,模型鼠的慢性受压脊髓没有明显器质性损伤。炎症机制探讨研究方面,模型组与对照组相比,p65、IL-6、IL-1 β、TNF-α mRNA表达量在造模1月后均有升高。(P0.05)蛋白免疫印迹法提示在造模后1月时,模型组磷酸化p65和TNF-α的蛋白表达均高于对照组。(P0.05)免疫组织化学检测发现模型组活化小胶质细胞和NF-kappa B通路活化的细胞数量造模后1月时均高于对照组,(P0.05)而神经细胞数量没有差异。(P0.05)酶联免疫吸附测定法结果显示模型组大鼠脊髓内IL-6、IL-1β蛋白表达量在1月时升高。(P0.05)造模后1月内BBB评分提示两组大鼠的神经功能无明显差别。(P0.05)补肾活血方干预及NF-kappa B信号通路调节炎症研究方面,药物组、抑制剂组、药物+抑制剂组与模型组相比,p65 mRNA表达量均有降低。(P0.05)此外,药物+抑制剂组p65 mRNA表达低于药物组。(P0.05)除IL-6的抑制剂组和模型组之间没有统计学差异外,(P0.05)IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表达量各干预组均较模型组具有降低,(P0.05)药物+抑制剂组的TNF-α mRNA表达量低于药物组和抑制剂组。(P0.05)Western Blot表明药物+抑制剂组的磷酸化-p65(pp65)表达低于其他各组,(P0.05)抑制剂组低于模型组。(P0.05)模型组TNF-α表达高于其他各组,药物组和抑制剂组的TNF-α表达高于药物+抑制剂组(P0.05)。IHC检测发现药物组、抑制剂组、药物+抑制剂组的活化小胶质细胞计数均低于模型组,(P0.05)抑制剂组高于药物+抑制剂组。(P0.01)神经细胞计数在各组之间没有差异。(P0.05)各组p65阳性的细胞数量均低于模型组,(P0.05)药物+抑制剂组低于抑制剂组和药物组。ELISA检测表明除了抑制剂与模型组之间的IL-6蛋白表达差异不明显外,模型组的IL-6和IL-1 β高于其他各组,药物组和抑制剂组的IL-6和IL-1 β均高于药物+抑制剂组(P0.05)。结论:1.颈肩及上臂刺痛来就诊,或存在颈椎不稳的无髓性损伤的慢性颈脊髓压迫患者颈椎JOA评分中远期下降的幅度可能更大,而颈脊髓压迫比例和就诊时疼痛程度与颈椎JOA评分下降的幅度没有关联。2.髓性损伤的慢性颈脊髓压迫大鼠模型的受压脊髓节段内存在炎性反应,并且与NF-kappa B通路激活有关。3.药补肾活血方对脊髓慢性受压所致炎症有抑制作用,并且与NF-kappa B通路抑制剂的效果相互叠加,但不一定是通过该通路起作用的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R274.9
【参考文献】
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本文编号：
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