左右旋龙脑等萜类成分对P-糖蛋白影响作用及机制研究

发布时间：2018-12-07 09:48

【摘要】：目的:P-糖蛋白(p-gp)是肿瘤多药耐药发生的主要因素,目前尚无理想的抑制药物。为研究多种萜类化合物对p-gp的抑制作用,本文从药-药相互作用的角度进行药效探讨、并从p-gp转运活性、蛋白和基因表达、细胞能量供给、药物动力学等方面进行机制研究,最后还结合分子模拟进行分析,为其开发提供依据。方法:本论文首先通过研究多种萜类成分与盐酸米托蒽醌的联合给药,筛选出具有协同增敏作用的候选活性成分;然后通过探讨候选活性成分对p-pg的转运活性、蛋白和基因表达、细胞ATP酶活性的影响,探讨活性成分对P-gp影响的环节;通过分析口服给药活性萜类化合物对P-gp底物的药物动力学参数改变,探讨其影响体内P-gp对药物口服吸收的作用;最后结合计算机分子模拟,探讨候选萜类成分与P-gp结合的分子机制。其具体步骤如下:1.以人源子宫肉瘤细胞非耐药细胞株MES-SA以及其耐药细胞株MES-SA/MX2细胞为研究对象,观察细胞的生长形态,并结合细胞生长曲线的分析,确定后续实验采用的细胞密度范围;通过比较非耐药细胞株与耐药细胞株P-gp蛋白及基因表达、转运活性等,确证所选用细胞为P-gp耐药机制的细胞株。2.以MTT检测法确定萜类成分对MES-SA/MX2细胞的增殖抑制作用,确定萜类成分的试验剂量。3.采用MTT法测定萜类成分和不同浓度的盐酸米托蒽醌联合给药后对MES-SA/MX2细胞的生长抑制率,并计算出IC50和耐药倍数,筛选出具有协同增效作用的萜类化合物作为逆转P-gp介导的多药耐药作用的候选萜类活性成分。4.以P-gp荧光探针四甲基罗丹明甲酯(TMRM)作为底物,采用流式细胞术检测候选活性萜类成分给药后MES-SA/MX2细胞的TMRM荧光强度,探讨萜类成分对P-gp转运功能的影响。5.分别采用蛋白印迹法(WB)法和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定候选活性萜类活性成分对MES-SA/MX2细胞中P-gp的蛋白和基因MDR1表达,探讨候选萜类成分对P-gp表达的影响。6.使用ATP酶试剂盒,测定候选活性萜类成分对MES-SA/MX2细胞ATP酶的活性影响,探讨候选活性萜类成分对细胞能量供给的影响。7.使用SD大鼠进行药物动力学实验,测定活性萜类成分对葛根素的药物动力学影响,探讨萜类成分对P-gp底物的体内吸收影响。8.选用计算机分子模拟方法,研究活性萜类成分与P-gp蛋白的分子对接,并与已知的抑制剂的结合氨基酸位点比较,总结活性萜类分子逆转P-gp外排作用的结合情况。结果:1.根据MES-SA和MES-SA/MX2的验证实验结果,MES-SA细胞的生长形态为梭形,贴壁性好;而MES-SA/MX2细胞的形态主要为圆形,部分为梭形,贴壁性较差。盐酸米托蒽醌对两种细胞的增殖抑制影响明显不同,盐酸米托蒽醌对MES-SA细胞的IC50为 1.23 uM,而对 MES-SA/MX2 细胞的 IC50为 97.5 μM,显示 MES-SA/MX2 细胞的耐药性明显高于MES-SA细胞。WB和RT-qPCR结果显示,MES-SA细胞几乎不表达P-gp,而MES-SA/MX2细胞大量表达P-gp。阳性对照药物维拉帕米能下调P-gp蛋白表达。荧光结果显示MES-SA细胞比MES-SA/MX2细胞具有更强烈的TMRM荧光,流式细胞术结果表明MES-SA/MX2细胞的P-gp外排能力比MES-SA细胞更强。综合以上实验结果,表明MES-SA/MX2细胞具有更强的耐药性,其原因是由P-gp介导的多药耐药性造成的。2.根据各萜类化合物对MES-SA/MX2细胞的MTT实验结果,各化合物对细胞的增殖抑制作用不同,选择低于IC20的试验药物浓度进行后续的联合用药实验。本实验最终选择用于联合实验的萜类化合物浓度分别为:①单萜类:艾片(10 μM、50μM),天然冰片(10 μM、50 μM),合成冰片(10 μM、50 μM),芍药苷(20μM)。②倍半萜类:青蒿素(20 μM),双氢青蒿素(20 μM),广藿香醇(20μM)。③二萜类:穿心莲内酯(5 μM、20 μM),异穿心莲内酯(20 μM、50μM),穿心莲酸(20 pM、50 μM),脱水穿心莲内酯(20 μM、50 μM),脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠(20 μM、50 μM)。④三萜类:人参皂苷Rb1(20 μM),人参皂苷Rb3(20 μM),人参皂苷Rh1(20 μM),人参皂苷Rh2(20 μM),人参皂苷Rd(20 μM),人参皂苷Rc(20 μM),三七皂苷Rb1(20 μM),三七总皂苷(20μM),柴胡皂苷A(5 uM),柴胡皂苷B2(5 μM),柴胡皂苷C(5 uM),柴胡皂苷D(2 μM),齐墩果酸(5 μM)、熊果酸(5 μM)、甘草次酸(5 pM)、白桦脂酸(5 μM)、吴茱萸内酯(5 μM)、川续断皂苷Ⅵ(5 μM)、绞股蓝皂苷(5μ M)。3.萜类化合物的增敏作用研究:非耐药细胞的耐药倍数为1.00,耐药细胞的耐药倍数为79.39,阳性对照维拉帕米的耐药倍数为4.16,显示出显著的多药耐药逆转作用。通过实验得到降低细胞耐药倍数的候选活性成分及对应浓度的结果如下:①单萜类:艾片低高浓度(10 μM、50 μM)的耐药倍数分别为27.33和9.66、天然冰片低高浓度(10 μM、50 μM)的耐药倍数分别为65.89和15.72、合成冰片低高浓度(10 μM、50 μM)的耐药倍数分别为78.74和22.81。②二萜类:穿心莲内酯5 uM的耐药倍数为56.27、异穿心莲内酯20 μM的耐药倍数为37.41、脱水穿心莲内酯20 μM的耐药倍数为35.02、脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠20 μM的耐药倍数为37.30。4.P-pg转运活性实验以候选活性成分影响TMRM的细胞荧光强度来评价,以空白组的相对荧光强度为100%,阳性对照药物维拉帕米能显著提高TMRM的胞内荧光强度,当浓度大于50 μM后,TMRM荧光强度趋于稳定,相对荧光强度达到172.1%。候选的萜类化合物的相对荧光强度结果显示:①单萜类:艾片低中高浓度(1,10,50μM)分别为 111.5%(P0.01),116.2%(P0.01),123.0%(P0.01);天然冰片低中高浓度(1,10,50 μM)分别为 100.0%,104.5%(P0.01),104.7%(P0.01);合成冰片低中高浓度(1,10,50 μM)分别为 103.3%(P0.05),103.9%(P0.01),104.2%(P0.01)。②二萜类:穿心莲内酯系列浓度(1,10,25,50,100 μM)分别为100.8%,101.4%,106.5%(P0.05),107.9%(P0.05),108.0%(P0.05);异穿心莲内酯系列浓度(1,10,25,50,100 μM)分别为 98.9%,98.7%,104.0%(P0.05),104.4%(0.05),122.9.0%(P0.01)。脱水穿心莲内酯系列浓度(1,10,25,50,100 μM)分别为 103.9%,104.0%,113.1%(P0.01),122.6%(P0.01),148.8%(P0.01);脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠系列浓度(1,10,25,50,100 μM)分别为 101.1%,102.6%,110.0%(P0.01),108.5%(P0.05),115.7%(P0.01);5.候选活性成分对P-gp蛋白表达影响结果:空白对照组的表达量为100%。①单萜类:艾片低中高浓度(10,20,50 μM)的P-gp表达量分别为71.6(P0.01),90.4%(P0.05),114.5%;天然冰片低中高浓度(10,20,50 μM)的P-gp表达量分别为 78.9%(P0.05),74.4%(P0.05),70.7%(P0.05);合成冰片低中高浓度(10,20,50 μM)的 P-gp 表达量分别为 66.2%(P0.01),79.0%(P0.05),97.8%。②二萜类:穿心莲内酯低中高浓度(1,5,10 μM)的P-gp表达量分别为87.4%(P0.05),68.5%(P0.01),40.7%(P0.01);异穿心莲内酯低中高浓度(1,10,100 μM)的 P-gp 表达量分别为 74.5%(P0.01),76.4%(0.01),81.8%(P0.01);脱水穿心莲内酯低中高浓度(1,10,100 μM)的P-gp表达量分别为86.1%,85.0%(P0.05),70.2%(P0.05);脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠低中高浓度(1,10,100 μM)的 P-gp 表达量分别为 98.2%,97.6%,127.2%。6.候选活性成分对MDR1表达结果:以空白对照组的MDR1表达量为100%。①单萜类:艾片20 μM、天然冰片20 μM、合成冰片20 μM的表达量为82.1%(P0.01),101.4%,95.3%(P0.01)。②二萜类:穿心莲内酯5 μM、异穿心莲内酯20 μM、穿心莲酸20 μM、脱水穿心莲内酯20 μM、脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠20 M的表达量为 94.7%(P0.01),83.1%(P0.01),97.2%,91.0%,93.6%。7.ATP酶试剂盒测定活性成分对细胞的ATP酶活性结果:空白对照组的酶活力为1.0494 U/mgProt。①单萜类:艾片的低中高浓度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分别为 0.9376(P0.05),0.9402(P0.05),0.9322(P0.05)U/mgProt。天然冰片的低中高浓度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分别为1.084,1.066,0.9665(P0.05)U/mgProt。合成冰片的低中高浓度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分别为 1.087,0.9874,0.9348(P0.05)U/mgProt。②二萜类:穿心莲内酯 5 μM,异穿心莲内酯20 μM,穿心莲酸20 μM,脱水穿心莲内酯20 μM,脱水穿心莲内酯亚硫酸氢钠 20 μM 分别为:0.9786(P0.05),1.0904,1.0383,1.1006,1.0520 U/mgprot。8.综合细胞水平的药效结果,选择了互为空间异构体的部分冰片类成分和穿心莲内酯等成分在大鼠上进行药物动力学实验,考察对P-gp底物葛根素的药物动力学影响。结果显示:①单萜类的艾片的作用比天然冰片强:艾片(100 mg ·Kg-1)能够升高葛根素的AU(C(0-t)达71.9%(P0.01)、AUC(0-∞)达62.4%、提高Cmax提高374.4%(P0.05),缩短其 Tmax 达 50%(P0.05)、CLz/F 显著降低 24.3%(P0.05);天然冰片(100 mg· Kg-1）对葛根素的Cmax存在一定程度的升高,缩短其Tmax时间,体现其影响葛根素吸收的作用,但与空白对照组比较无统计差异,且其作用不如艾片组的明显。②二萜类的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯作用比异穿心莲内酯作用强:穿心莲内酯(60 mg · kg-1)和脱水穿心莲内酯(60 mg · Kg-1)能够升高葛根素的AUC(0-t)分别为 30.7%和 27.3%、AUC(0-∞)分别为 27.2%和 67.3%(P0.05),提高 Cmax 分别为11.5%(P0.05)和26.9%(P0.05);异穿心莲内酯(60 mg· Kg-1)降低葛根素的AUC(0-∞)下降为对照组的71.4%,MRT(0-∞)下降40.2%,Tmax延迟332.7%(P0.01)。9.利用分子模拟技术,建立合理的人源P-gp蛋白结构。将底物、抑制剂与候选萜类分子跟P-gp蛋白上定义的两个结合口袋SBD1和SBD2进行分子对接并对氨基酸结合位点分析,发现P-gp跨膜区上的TM1、TM5、TM6、TM7、TM11和TM12等螺旋链参与配体对接的主要部分,其中MET192、GLN195、SER196、THR199、ILE306、TYR307、TYR310、PHE336、LEU339、ILE340、PHE343、SER344、GLN347、GLN725、PR0726、PHE728、ALA729、PHE732、PHE759、GLN946、MET949、TYR950、TYR953、IEU975、PHE978、SER979、VAL982、PHE983、MET986、MET68、MET69、LEU65 为对接频次最多的氨基酸。结论:1.艾片(左旋龙脑)、天然冰片(右旋龙脑)、合成冰片(消旋体龙脑)能够抑制P-gp介导的多药耐药作用,主要是影响P-gp蛋白表达和抑制其转运活性。这与其空间结构有关,体外和体内实验均显示左旋结构(艾片)比右旋结构(天然冰片)显示出更强的抑制活性。2.穿心莲成分中的5个结构显示了不同程度的P-gp抑制作用。穿心莲内酯和异穿心莲内酯内酯互为立体异构体,两种主要是影响了 P-gp的蛋白表达和转运功能,穿心莲内酯显示出更佳的P-gp抑制效果,其可以影响细胞的ATP酶活性,在体的研究更显示穿心莲内酯比异穿心莲内酯对底物的影响更加明显,说明空间结构的差异是两者表现出不同P-gp抑制程度的主要影响因素。脱水穿心莲内酯是5个穿心莲结构中影响p-gp作用最为明显的,其可能是对抑制p-gp的表达,转运活性等有关。3.分子模拟的结果显示P-gp抑制剂及底物与P-gp跨膜区上的TM1、TM5、TM6、TM7、TM11和TM12等螺旋链上部分氨基酸结合有密切关系,而实验中候选萜类化合物对这些氨基酸同样存在结合作用,因此研究这些结合位点与化合物的结合情况,有利于萜类P-gp抑制剂的筛选。综上所述,冰片等多种萜类化合物具有逆转P-gp活性的作用,但作用途径不尽相同,作用机制与其与P-gp空间结合能力有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】