microRNA-155对高糖致心肌纤维化的调节及机制研究

发布时间：2018-12-08 09:44

【摘要】：背景:microRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNAs群,其在转录后水平调控着相关基因的表达。microRNA-155(miR-155)是一种典型的多功能miRNA,其在机体代谢过程中发挥着重要的作用。为了深入研究miR-155的功能及其特点,十分需要建立其相关的基因敲除模型。目前,国内尚未见自主设计建立miR-155基因敲除小鼠模型的报道。近年来,随着基因筛查及修饰技术的革新,CRISPR/Cas 9技术现已作为一种常用有效的技术手段应用于基因研究中。在基因研究的动物实验中,基因敲除模型或者转基因动物模型也已经被广泛地应用。本实验旨在利用CRISPR/Cas 9技术构建microRNA-155基因敲除小鼠模型,并进而建立纯合子繁育体系。目的:利用CRISPR/Cas 9技术,构建miR-155基因敲除小鼠模型。方法:选择健康C57BL/6J小鼠,首先提取小鼠DNA并进行全基因组的扩增和测序,予以明确miR-155序列及位点;针对miR-155的结构特点,设计并构建Cas 9载体质粒(Cas9RNA)及打靶载体(sgRNA);随后将体外转录后的Cas9mRNAs及sgRNA,显微注射入小鼠的受精卵,并将受精卵进行体外培养;将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待代孕小鼠生育后得到F0代小鼠;通过对F0代小鼠进行DNA提取及基因型检测,确定基因敲除情况,进而建立并繁育miR-155基基因敲除小鼠模型纯合子体系。结果:实验共收集112个小鼠受精卵进行显微注射,发育良好形成胚胎的共94个;经sgRNA活性检测后,合格的胚胎共81个,随后将其移植到5只受孕小鼠体内;5只小鼠经21天左右分娩,共生育18只小鼠,其中1只死亡,余存活小鼠进行DNA提取及基因型检测分析;经基因测序后,出现基因改变的小鼠共7只,其中6只小鼠只出现单链单个碱基缺失,只有4号小鼠出现DNA单链碱基片段缺失,缺失长度为114 bp;对其进行繁育后,发现其基因型可以稳定传代,得到F1代杂合子小鼠3只;杂合子小鼠回交繁育,得到F2代纯合子基因敲除小鼠,并进行基因测序验证:基因敲除小鼠缺失片段包含microRNA-155主基因,成功敲除miR-155基因序列。结论:CRISPR/Cas 9技术能够快速、有效地构建miR-155基因敲除小鼠模型;且miR-155基因敲除小鼠,在清洁级的动物饲养环境中可以正常繁育。背景:近年来,研究发现miR-155参与了机体多种生物学过程,例如:免疫反应、炎症反应、病毒感染、肿瘤以及心血管疾病。尤其是在炎症反应及免疫反应过程中,炎性细胞、淋巴T细胞和淋巴B细胞的发生发展与miR-155的表达具有密切的联系。既往大量研究表明miR-155具有重要的生物学功能,但是在机体正常生理条件下,miR-155的生物学功能及特性研究尚未见报道。前期实验我们利用CRISPR/Cas 9技术,成功构建了miR-155基因敲除小鼠模型,并建立了纯合子体系。基于前期实验,我们将miR-155基因敲除小鼠与正常C57BL/6野生型小鼠进行比较研究,旨在探索正常生理条件下,miR-155的生物学功能及特性。目的:利用基因敲除模型,比较研究miR-155生物学特性。方法:随机选取miR-155基因敲除小鼠(KO组)与正常C57BL/6野生型小鼠(WT组),每组10只公鼠、10只母鼠,均8周龄,对其进行比较研究,包括:繁殖能力分析、生长曲线评估、腹部及心脏超声检查、血液学检查以及病理组织学检查。结果:我们对通过繁殖能力、生长曲线、超声检查、血液学检查以及病理组织学检查各项数据整理分析发现,各组主要检查指标均没有显著性差异。尽管在部分数据中出现了较大的差异,但在对照组与模型组组内也呈现出同趋势性变化,因此这些差异没有统计学意义。实验结果显示:在正常的生理条件下,对照组及模型组小鼠的生长发育均呈正常状态,组间无差异。通过本实验研究和总结近年来相关文献,我们发现在正常生理条件下,miR-155是一种非必需基因,其缺失对小鼠的生长发育无明显影响。结论:小鼠出生后42天期间,miR-155基因缺失对其生长曲线无明显影响;8周龄小鼠的正常生理条件下,miR-155的缺失对小鼠的生长发育无明显影响;因此,为了研究miR-155复杂的生物学功能,必须对miR-155基因敲除小鼠进行建模和干预。背景:糖尿病作为临床上最常见的疾病,常常引起多种疾病及并发症,例如眼底病变、神经性病变及纤维化病变。心肌纤维化是最常见的纤维化疾病之一,其也是心脏疾病中重要的病理表现之一。心肌纤维化可导致致命性的心肌损伤,例如心功能不全,甚至心脏衰竭。但是目前临床上缺少相应的靶向药物可以预防或者治疗心肌纤维化。既往研究表明,在心肌纤维化的进展中,胶原的合成和沉积是导致纤维化加重最主要的原因之一。据报道,高糖可以加速胶原的生成,进而加重纤维化程度,从而引起心肌损伤。miR-155是一种典型的多功能miRNAs,研究发现其参与调控了多种纤维化疾病过程。但是miR-155对心肌纤维化的影响机制尚未见报道。目的:探究miR-155在高糖所致心肌纤维化中的作用机制及其生物学功能。方法:我们选取miR-155基因敲除小鼠(KO组)与正常C57BL/6野生型小鼠(WT组)建立高糖模型(链脲佐菌素腹腔注射);建模后30天、60天行心脏超声予以评估小鼠心功能情况;随后进行病理组织学检查(HE与天狼星红染色)评估小鼠心肌损伤情况。此外,我们对正常C57BL/6野生型小鼠进行心脏原代成纤维细胞提取并进行miR-155的转染(miR-155抑制、miR-155过表达及阴性对照),进而研究miR-155对心肌纤维化过程中的具体影响机制。结果:建模30天后,所有小鼠均存活,并进行心脏超声检查,结果显示:仅正常高糖组小鼠出现轻微的心功能损伤,敲除高糖组未发现明显心脏损伤;建模60天后,正常高糖组小鼠死亡3只小鼠,敲除高糖组死亡1只小鼠,余各组均存活,所有存活小鼠均进行心脏超声检查,结果显示:糖尿病各组小鼠均出现显著的心功能损伤,而且与正常高糖组相比,敲除高糖组心脏损伤程度明显减轻。病理检测(天狼星红)结果显示:对正常组相比,糖尿病组小鼠均出现Ⅰ型及Ⅲ型胶原的显著增多;与敲除高糖组相比,正常高糖组细胞及组织间隙的胶原沉积程度明显加重。另外,HE染色结果显示:与敲除高糖组相比,正常高糖组心肌组织出现明显的结构损伤。细胞实验结果显示:经高糖刺激后,与正常低糖组相比,正常高糖组出现明显Ⅰ型胶原的高表达。miR-155过表达高糖组Ⅰ型胶原的表达量最高。同时,与正常高糖组相比,miR-155抑制高糖组Ⅰ型胶原的表达出现显著的降低;另外,与正常组相比,TGF-β1、Smad2以及磷酸化的Smad2均在miR-155抑制时出现显著的下调,在miR-155过表达时出现了显著的上升。结论:miR-155基因敲除后可以延缓高糖导致的心肌纤维化,并且miR-155可以通过TGF-β1-Smad 2信号通路调控心肌纤维化过程。研究表明,miR-155可能是治疗高糖所致心脏纤维化的潜在作用靶点。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R542.2

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