脉冲电磁场对雪旺细胞的激活作用及其在周围神经损伤修复中的应用

发布时间：2017-01-18 15:08

  本文关键词：脉冲电磁场对雪旺细胞的激活作用及其在周围神经损伤修复中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

《第四军医大学》 2015年

脉冲电磁场对雪旺细胞的激活作用及其在周围神经损伤修复中的应用

刘靓  

【摘要】：周围神经损伤是临床上常见的创伤类型,尤其是长节段的神经缺损一直是最为棘手的治疗难题之一。虽然自体周围神经移植可以促进神经再生并恢复一定的功能,然而自体神经移植具有很大的局限性,如二次手术损伤和供区感觉等功能的缺失。此外,供体神经来源有限以及供、受体神经直径不匹配等因素也限制了自体神经移植的应用。越来越多的学者尝试用组织工程神经支架来修复神经缺损,而对于长节段的神经缺损,单纯依靠支架材料进行修复往往存在神经生长时间过长,靶肌肉萎缩程度严重等现象,修复效果并不理想。大量研究表明,在神经修复材料局部构建良好的生物学微环境,是决定神经缺损修复效果的关键。有研究表明将种子细胞复合在神经支架内部,可改善神经再生的微环境,起到有效的促神经再生作用。雪旺细胞作为周围神经系统的主要胶质细胞,在周围神经损伤的修复中具有非常重要的作用,也是最常用的种子细胞之一。然而,雪旺细胞经分离培养后,其合成及分泌神经营养因子和细胞粘附分子的能力显著下降,不能持续、高效的合成神经营养因子等有利于神经再生的分子,在一定程度上限制了雪旺细胞构建神经支架局部生物学微环境的能力。因此需要寻找一种能方便、有效激活雪旺细胞,使其保持生物活性的技术来解决上述问题。有研究表明,电磁场作为一种安全、经济、无创、易实施的物理方法,可有效的调节多种细胞的生物学性能,包括分化、增殖、凋亡、伸展和迁移等,并且可以促进神经元突起的生长,延缓靶肌肉的萎缩,加速创伤愈合等。本研究应用脉冲电磁场(2.0 m T;50Hz)干预雪旺细胞4小时,发现可促进雪旺细胞的增殖并激活其合成、分泌多种神经营养因子(BDNF,GDNF,VEGF),并进一步通过体内试验发现,将雪旺细胞与神经导管相复合,同时辅以脉冲电磁场进行实时刺激,可有效促进大鼠12mm坐骨神经缺损的修复,提示了脉冲电磁场可通过激活移植雪旺细胞等作用,从而促进神经的再生和功能的恢复。第一部分脉冲电磁场参数的选择及其对雪旺细胞的激活效应目的:筛选最佳的磁场参数,探究脉冲电磁场对雪旺细胞生物学行为的影响。方法:将接种的雪旺细胞分为5组,依次以0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 m T;50 Hz的脉冲磁场分别干预各组细胞4小时。24小时后使用流式细胞技术检测雪旺细胞的凋亡,扫描电镜观察雪旺细胞的形态,根据检测结果筛选最佳磁场强度。随后在最佳磁场参数下分别刺激雪旺细胞(0.5、1、2、3、4、5、6和8小时),刺激完成后的24和48小时应用CCK-8检测雪旺细胞的活性,以确定磁场的干预时间。将雪旺细胞在2.0 m T;50Hz的磁场参数下作用4小时,采用Ed U-labeling量化分析磁场作用后12小时、24小时雪旺细胞的增殖情况,通过RT-PCR检测脉冲电磁场干预后雪旺细胞神经营养因子m RNA水平的表达,ELISA检测神经营养因子的分泌情况。结果:雪旺细胞在0.5、1.0、2.0 m T;50 Hz的脉冲电磁场干预下,无明显的细胞凋亡现象,当磁场强度增加至5.0 m T和10.0 m T时,细胞出现明显凋亡;扫描电镜观察发现当磁场强度低于2.0 m T时,雪旺细胞的形态良好,细胞延展成典型的双极性形态,然而当磁场强度继续升高至5.0 m T时,雪旺细胞表面出现空泡,细胞呈圆形且延展性变差,失去了雪旺细胞原有的形态特征。继续将磁场强度增加到10.0m T时,可以观察到雪旺细胞的细胞膜已碎裂,细胞形态完全破坏,雪旺细胞彻底凋亡。通过CCK-8检测发现,在磁场下作用4小时雪旺细胞的活性达到最佳,当刺激时间继续延长时,其活性并没有发生明显的变化。雪旺细胞在脉冲电磁场(2.0 m T;50Hz)干预后12小时和24小时,Ed U结果显示雪旺细胞明显增殖,其合成和分泌神经营养因子BDNF、GDNF、VEGF的能力也有显著提高。结论:2.0 m T;50 Hz为最佳磁场参数,4小时为合理干预时间;该参数的脉冲电磁场可有效激活雪旺细胞,促进雪旺细胞的增殖,并促进其合成和分泌多种神经营养因子。第二部分胶原-壳聚糖神经导管的构建及相关性能参数测试目的:构建具有良好的生物相容性、可降解性的胶原-壳聚糖神经导管,并进行相关性能参数测试。方法:将胶原与壳聚糖以4:1的比例在冰醋酸中混合,通过梯度冷淋及冷冻干燥技术制备胶原-壳聚糖神经导管,扫描电镜观察其微观结构,并对其孔隙率、体外降解率、吸水膨胀率、抗拉强度进行相关测定。结果:扫描电镜下观察神经导管的横截面为蜂窝状多孔立体结构,微孔间彼此连通交错,从而有利于营养物质及代谢产物的运输和交换。该导管具备良好的生物相容性、降解性、吸水膨胀性,以及抗拉强度等特点,为再生的神经纤维提供了良好的微环境,同时其中空样的结构有利于种子细胞的移植。结论:胶原-壳聚糖神经导管具有良好的微观结构和理化性质,是一种理想的组织工程神经。第三部分雪旺细胞复合神经导管在脉冲电磁场的作用下修复坐骨神经缺损的有效性研究目的:探究雪旺细胞作为种子细胞与神经导管相复合,在脉冲电磁场的刺激下,修复周围神经缺损的有效性。方法:将雪旺细胞与胶原-壳聚糖导管相复合,用于修复大鼠12mm坐骨神经缺损,在术后12周同时辅以脉冲电磁场刺激(2.0 m T;50Hz),以实现对移植雪旺细胞的实时激活,分5组(1自体神经移植组;2 Scaffolds组;3 Scaffolds+PMF组;4Scaffolds+Scs组;5 Scaffolds+Scs+PMF组),对照比较其神经修复效果的有效性。通过对再生神经形态学(透射电镜)的观察和功能学(荧光金逆行示踪;坐骨神经指数和神经电生理检测)的分析以及靶肌肉的染色来评价其修复效果,并用RT-PCR检测再生神经营养因子的表达,初步探究其再生机制。结果:术后12周,电磁场作用下的雪旺细胞与胶原壳聚糖导管复合组可观察到更多均匀分布的轴突,再生神经纤维的数量和直径明显高于其他各组,并最接近自体神经组。该组靶肌肉HE染色显示腓肠肌萎缩情况得到明显缓解,脊髓前角运动神经元和DRG感觉神经元的数目显著高于其他各组,坐骨神经指数的逆转速度高于其他几组,神经传导速度、潜伏期和波幅也显著好于其他几组,并与自体神经组无差异,同时该组的BDNF、GDNF以及VEGF基因的表达水平明显升高。结论:雪旺细胞与神经导管相复合,同时辅以脉冲电磁场进行实时刺激,可构建有利于神经再生的微环境,有效促进周围神经缺损的修复。

【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R745;R454.1
【目录】：

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