去甲基化酶KDM4C影响肿瘤细胞增殖与代谢重编程的分子机制研究

发布时间：2019-01-03 14:40

【摘要】：表观遗传学是涉及基因表达可遗传的变化但DNA序列未改变的研究。表观遗传调控的机制包括DNA和组蛋白修饰,染色体重组及无编码RNA等。现在越来越多的证据显示表观遗传的异常调控是促进肿瘤发生的原动力之一。众所周知,肿瘤细胞通过重编程细胞内代谢来满足其生长和增殖所需要的大量的营养物质。细胞代谢重编程不仅改变了细胞命运,还改变了普通细胞的代谢途径:有氧糖酵取代了正常的有氧呼吸和糖酵解途径,将其从产生能量的分解代谢通路转变为生物合成通路,进而为氨基酸,核酸和脂类等的生物合成提供了原料,进一步满足了细胞生长和增殖的合成代谢需要。而我们的前期研究显示KDM4C在肿瘤细胞命运和细胞代谢重编程中起着重要作用,且其在多种肿瘤细胞中都是基因扩增和高表达的,包括淋巴瘤(lymphoma),乳腺癌(breast cancer),食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma),肺肉瘤样癌(lung sarcomatoid carcinoma)和人髓母细胞瘤(medulloblastoma)。因此针对KDM4C的研究,有利于我们认清组蛋白甲基化修饰表观调控细胞命运和代谢重编程的分子机制,为治疗肿瘤相关疾病提供一些药物靶标的参考。本论文对组蛋白去甲基化酶KDM4C主导的协调氨基酸代谢和细胞周期进程之间联系的表观遗传学机制进行了探究;同时发现了KDM4C与转录激活因子ATF4之间的关系。这些结果都揭示了KDM4C在肿瘤形成及扩张中具有一些新的生物学功能,其结论如下所示:1.KDM4C基因对于丝氨酸生物合成信号通路基因的表达和肿瘤细胞的增殖是必须的在细胞水平将KDM4C基因沉默后,我们发现肿瘤细胞内H3K9me3的整体水平明显上调;而同为KDM4家族的具有相似功能的其他基因的m RNA表达水平无明显的增加,这说明KDM4C对H3K9me3的去甲基化是一个相对独立的过程,且沉默KDM4C对其他KDM4家族基因无明显的影响。此外,沉默KDM4C明显地抑制了肿瘤细胞生长增殖和形成细胞克隆的能力,这和Cloos et al.,Kim et al.等人的结果一致。另外,我们对BE(2)-C细胞进行了染色质免疫共沉淀实验,,并做了Ch IP-q PCR;结果显示,KDM4C可结合在丝氨酸生物合成通路中的某些基因的启动子区域。我们将Pedersen et al.等人在人类食管鳞状细胞癌细胞(human esophageal squamous cell carcinoma)KYSE150中沉默KDM4C的Ch IP-seq数据结果与人类基因组进行了比对分析,发现丝氨酸生物合成信号通路基因位点下均有较大峰值(peak)出现,这与我们Ch IP-q PCR数据结果一致。由此可说明KDM4C对这些基因都有激活转录调控的作用。换而言之,KDM4C对丝氨酸合成信号通路的激活起着重要的作用。总之,我们的数据证实至少在表观遗传调控被激活时期,KDM4C参与了对丝氨酸生物合成信号通路的激活过程;KDM4C蛋白可能是激活该通路的必不可少的一个蛋白。2.过表达KDM4C基因可转录激活丝氨酸生物合成信号通路进而促进肿瘤细胞的增殖较早的研究表明,KDM4C基因在人类多种肿瘤细胞系中都有异常的高表达。由于KDM4C是一个去甲基化酶,因此我们用诱导表达系统来研究其调控基因的机制。我们在细胞水平将KDM4C过表达后,发现肿瘤细胞内H3K9me3的整体水平明显下降,而H3K9me1的整体水平明显上调,且H3K9me2的整体水平无明显的变化。此外,KDM4C的过表达不仅提高了肿瘤细胞的增殖能力,还提高了其在动物体内形成肿瘤的能力。这样的现象有可能是KDM4C过表达后,对丝氨酸信号通路各基因的上调所导致的。我们通过在m RNA水平和蛋白质水平检测这些基因,发现其都有一定程度上的提高。为了更准确的证实我们的推测,我们进一步地设计了Ch IP-q PCR实验,其数据结果正如我们所料,KDM4C的过表达果然提高了其与PHGDH和PAST1启动子DNA区域的结合度。这说明KDM4C对丝氨酸生物合成信号通路起着至关重要的作用,同时这也说明其在促进肿瘤细胞的增殖生长中也起着重要作用。3.KDM4C的表观调控对肿瘤细胞氨基酸生物合成信号通路和运输途径的转录激活起着核心作用。由RNA Microarray基因芯片的分析,我们可以知道KDM4C在氨基酸生物合成和转运的转录激活起着核心作用。为了验证KDM4C与氨基酸合成的关系,我们利用RT-q PCR检测与氨基酸合成相关的基因,发现其显著上调,比如ASNS,ASS1,CTH,GOT1,GPT2等;而这些基因参与丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸和谷氨酸等相关氨基酸的生物合成。这也进一步验证KDM4C确实参与了氨基酸生物合成的过程。同样的,我们也发现SLC1A4,SLC1A5,SLC3A2,SLC6A9,SLC7A1,SLC7A5和SLC7A11等相关转运蛋白基因也显著性上调;而这些基因几乎涉及到了所有种类氨基酸的转运过程,仅仅除了脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺这三种氨基酸。此外,Pedersen等人的Ch IP-seq实验数据也显示KDM4C与ASNS、ASS1、GPT2、SLC1A5和SLC7A1等基因的启动子DNA区域有结合的峰值。以上两个方面均证实KDM4C是氨基酸生物合成与转运过程中一个重要的因子。除此之外,我们也做了气相色谱-质谱实验,其数据分析结果显示15个氨基酸的生物合成能力都有提高;而氨基酸的水平提高对激活m TOR1信号通路是最关键的一步。m TOR1通过刺激细胞内高分子的生物合成以及生物周期进程来提高细胞的生长增殖能力的。这说明KDM4C在肿瘤细胞氨基酸的生物合成和转运中起着核心作用。4.KDM4C需ATF4介导转录激活丝氨酸生物合成途径激活转录因子ATF4在细胞氨基酸缺乏应答中起着关键的作用。而我们的结果数据显示KDM4C可以直接上调或下调ATF4基因的m RNA水平或蛋白水平,且KDM4C可结合在ATF4的启动子区域,这和Pedersen等人的研究是一致的;这说明KDM4C确实可以直接调控ATF4基因。紧接着我们研究了KDM4C对ATF4是否有生理学功能方面的作用。众所周知,在氨基酸缺乏时,ATF4的表达可以特异性的升高。而我们的实验发现,当丝氨酸缺乏时KDM4C与ATF4的启动子区域结合显著性增加,与H3K9me3结合显著性降低。当KDM4C被沉默后再进行丝氨酸缺乏实验时,结果发现ATF4的m RNA水平和蛋白质水平都没有显著性的上调。这说明在丝氨酸缺乏时,KDM4C是维持ATF4基因正常表达水平的关键因子之一。先前有报道显示,ATF4可以直接调控丝氨酸合成通路基因PHGDH和PSAT1,于是我们推测ATF4可能是KDM4C的下游功能基因。因此我们先将KDM4C过表达然后再沉默ATF4,结果数据显示沉默ATF4几乎完全抑制了KDM4C促进肿瘤细胞增殖的能力,同时也几乎完全抑制了KDM4C对丝氨酸生物合成信号通路基因的上调作用;更有趣的是,KDM4C和ATF4与丝氨酸生物合成信号通路基因PHGDH启动子区域的结合也下降了,而H3K9me3与PHGDH启动子区域的结合却又显著性的升高。于是我们推测ATF4与KDM4C可能是结合在一起共同地发挥生物学功能,接着我们做了ATF4和KDM4C的Co-IP实验,结果显示它们确实是结合在一起的。这说明在丝氨酸缺乏的情况下,KDM4C和ATF4结合在一起对丝氨酸生物合成信号通路基因进行转录调控作用的。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2

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