基于药物代谢和转运的吗啡镇痛效应机理研究

发布时间：2019-01-19 16:53

【摘要】：疼痛的预防和治疗一直以来是国际医学领域的研究热点。对于创伤、手术、烧伤等引发的阵痛或肿瘤放疗、化疗引发的强烈疼痛,阿片类药物吗啡具有很好的镇痛效果。然而,吗啡用药后产生的耐受性等却严重阻碍了其药效的发挥。吗啡主要由尿苷葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 2B7,UGT2B7)介导,通过与葡萄糖醛酸分子发生结合反应形成吗啡-3-葡萄糖醛酸苷(morphine-3-glucuronide,M3G)和吗啡-6-葡萄糖醛酸苷(morphine-6-glucuronide,M6G)两种主要代谢产物,其中M6G的镇痛能力远强于吗啡原型,M3G则没有明显的镇痛活性,但是却能拮抗M6G产生的耐受作用。因此,使用吗啡镇痛时,若在耐受发生后M6G的生成适当减少将有助于镇痛效果的发挥。吗啡代谢产物生成后需要通过血脑屏障进入中枢神经系统发挥镇痛作用,但是目前对于吗啡及其葡萄糖醛酸代谢物如何进入脑内的机制尚未明确。本文从吗啡的代谢和转运角度,重点研究主要药物代谢酶和血脑屏障摄取转运体对吗啡代谢产物生成和转运的选择性机制,分析基因多态性、蛋白二聚化、表观遗传因素、内源性代谢物等对吗啡镇痛效果及耐受性逆转作用的影响。1.吗啡及其两种葡萄糖醛酸代谢物的HPLC-MS/MS分析方法的建立为了对吗啡的两种代谢物浓度进行分析,我们建立了用于在不同生物基质中快速检测吗啡及其葡萄糖代谢产物M3G和M6G的浓度的HPLC-MS/MS方法。以lOng/mL 同位素标记的 M6G-d3 为内标,采用 AglientHILICPLUSSB-C18(2.1_mm×50mm,3.5μm)色谱柱和含有0.5‰甲酸的纯水溶液和纯甲醇溶液(pH3.2)作为流动相,梯度洗脱对样品进行分离。质谱仪在正离子模式下采用多离子反应检测模式(mltiplereaction monitoring,MRM),三种特征离子碎片分别为吗啡m/z286.0-200.9,M3G 和 M6G 均为 m/z462.1-286.1,M6G-d3 为 m/z465.1-289.1。验证结果显示,该方法的专属性良好,在各基质中三种化合物的线性范围为0.05ng到10ng,范围内线性相关系数r2值均在0.9930以上,定量下限(LLOQ)均为0.05ng/mL,低中高浓度待测物精密度和准确度的相对标准偏差和偏差范围均符合相关要求,同时在不同基质中无明显的基质效应存在,样品稳定性良好。因此,该方法可用于吗啡及两种葡萄糖醛酸代谢物在不同生物基质中浓度测定。2.UGTs及其突变体之间的二聚化作用对吗啡葡萄糖醛酸化代谢的影响研究UGT2B7、UGT1A1和UGT1A9及其它们的突变体蛋白之间能发生二聚化,并影响催化吗啡代谢的选择性。我们应用UGTs重组蛋白包括野生型UGT2B7*1及三个突变体*71S(A71S,211GT)、*2(H268Y,802CT)、*5(D398N,1192GA)重组蛋白及其与 UGT1A9*1、UGT1A9*2(C3Y,8GA)、UGT1A9*3(M33T,98TC)、UGT1A9*5(D256N,766GA)、UGT1A1 及剪切突变体 UGT1A1b 分别形成的二聚体,采用HPLC-MS/MS方法测定孵育液中吗啡代谢物M3G和M6G浓度,并进行酶动力学参数分析。研究表明:相比于UGT2B7野生型和突变体,它们与UGT1A1和UGT1A9形成的蛋白二聚化重组酶能够显著提升催化吗啡代谢的能力。相比于UGT2B7*1、UGT2B7*2突变体、二聚化重组酶催化吗啡生成M3G和M6G时具有更低的Km值;而UGT2B7*5却与之相反。研究还显示,UGT1A9*2或UGT1A9*5与UGT2B7形成的二聚化重组酶有利于M6G的生成;绝大多数UGT2B7的突变体或二聚化重组酶能够显著降低M3G与M6G的生成量比值,即生成较多的M6G。综上,UGT2B7野生型或突变体与UGT1A1、UGT1A9野生型或突变体之间形成的二聚化作用在改变酶的活性同时影响吗啡代谢产物生成的选择性。3.结直肠癌中UGT2B7表达降低对吗啡葡萄糖醛酸化代谢的影响和机制研究临床样品的分析结果显示UGT2B7在结直肠癌组织中显著性降低,提示表观遗传因素也可能影响UGT2B7催化吗啡的代谢。同时,UGT2B7底物吗啡能够在结直肠肿瘤细胞中通过上调组蛋白3位的正调节信号如H3K4Me3或H3K27Ac等来激活UGT2B7表达。深入研究发现脑源性分泌神经营养因子BDNF在结直肠肿瘤中能够与UGT2B7发生蛋白-蛋白相互作用并显著抑制后者的表达,其机制是激活其启动子上H3K27Ac的同时下调H3K4Me3信号。BDNF的下调导致多梳蛋白复合物PRC1激活,而由于核心元件SUZ12受到抑制,PRC2呈现相反的状态。吗啡的两种葡萄糖醛酸代谢物在BDNF被抑制、组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294、去乙酰化酶抑制剂TSA处理的耐受样HCT-116细胞中均明显增加,其中M6G的量增加更多。因此,吗啡用于肿瘤镇痛过程中,UGT2B7酶活性的降低和M3G/M6G增加可导致吗啡耐受性减弱。4.石胆酸介导的UGT2B7下调对于逆转吗啡耐受性作用的研究一些内源性化合物也会干预UGT2B7的活性作用发挥。如原发性胆汁性肝硬化病人往往伴随肝内的胆酸淤积,并诱发肝损伤,并通常会伴随着强烈疼痛的发生,需要强效镇痛药如吗啡进行止痛。我们发现吗啡耐受样细胞HL-7702给予次级胆酸石胆酸(LCA)后UGT2B7的表达水平明显下降。而吗啡耐受后原本表达下调的MOR受体和钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα),呈现出明显的逆转现象。小鼠给予LCA(10,50,100mg/kg)7天后能显著降低相同剂量吗啡给药引发的急性和慢性吗啡耐受性。鉴于小鼠肝脏内的UGT2B7有显著的下调,我们采用固相萃取(SPE)结合HPLC-MS/MS方法对急慢性吗啡耐受小鼠中代谢物M3G和M6G的浓度进行了测定,发现吗啡和M6G及M3G和M6G的比值均显著下调。在给予50mg/kg LCA后,急慢性吗啡耐受小鼠前额皮层中环磷酸腺苷cAMP浓度显著下降,T286位CaMKⅡα磷酸化水平显著上调,提示LCA能够影响耐受小鼠脑内信号的磷酸化水平。以上研究表明,LCA淤积能够导致小鼠肝脏内UGT2B7的表达下调,使得吗啡代谢的选择性改变,吗啡和M6G及M3G和M6G的比值均显著下降,进而减轻急慢性吗啡的耐受效应。因此,吗啡用于LCA淤积产生的疼痛治疗可能不易产生耐受,预期可增强其镇痛效果。5.OATP2B1介导的逆转吗啡急性耐受性的机制研究调控吗啡的脑转运过程能显著影响吗啡镇痛能力的发挥并改善其耐受状态。因此,我们开展了吗啡及代谢产物脑内摄取的新途径研究,结果显示有机阴离子转运多肽(OATP2B1)稳定表达细胞中吗啡和M6G的转运量明显高于MOCK细胞,该转运体与吗啡的亲和力是M6G的1.4倍(Km分别为吗啡57.58±8.9μM,M6G 80.31±21.75μM),同时环孢菌素A(CsA)作为OATP2B1的抑制剂能抑制吗啡和M6G的细胞摄取量(吗啡 IC50=3.90±0.50μM;M6G IC50=6.04±0.86μM)。为了探究OATP2B1对于吗啡的转运和耐受的影响,我们采用DGL-PEG/demorphin脑靶向复合体纳米粒携载siRNA(OATP2B1)在小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞中验证功能后给予小鼠尾静脉注射,发现小鼠大脑和小脑中OATP2B1的表达显著下调,而吗啡和M6G的浓度显著下降。同时我们发现下调OATP2B1同时给予产生达到耐受剂量的吗啡后,MOR受体和CaMKIIα均上调,而T286位磷酸化CaMKⅡα呈现下调,提示下调OATP2B1会阻断吗啡和M6G的脑转运,并逆转急性吗啡耐受。这一发现有助于进一步研究吗啡脑转运和镇痛活性之间的联系。上述研究对吗啡临床镇痛效果的改善具有参考意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285

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