TBL的生物活性及其对树突状细胞免疫调节功能的研究

发布时间：2019-01-26 09:50

【摘要】：植物凝集素是一类非免疫源的蛋白或糖蛋白,能可逆地、特异地与碳水化合物相互作用。它们广泛分布于动植物中。植物凝集素具有：抗虫、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等多种生物活性。利用植物凝集素作为生物机体中信息媒介这一个功能,将其应用于机体防御、体外给药,以及多种疾病的治疗具有一定的理论和实践意义。本研究通过ResourceTM Q离子交换柱和SuperdexTM 75 10/300 GL凝胶过滤柱对苦荞凝集素(Tartary buckwheat lectin, TBL)进行两步纯化,制备纯度较高的TBL,从TBL对DCs成熟和增殖的影响及其作用机理,诱导肿瘤细胞凋亡的作用,防辐射功能及对实体瘤小鼠治疗四个方面对TBL的生物学活性进行了较系统的研究。(1)采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析及ResourceTM Q离子交换柱和Superdex TM 75 10/300 GL凝胶过滤柱层析等方法从苦荞麦种子中提取、分离、纯化TBL,SDS-PAGE分析其分子量为65 kDa左右。对其凝血及酶学活性、酸碱稳定性、温度稳定性及金属离子稳定性等性质进行初步研究。结果显示TBL对4种人类血型、小鼠、大鼠及兔的红血球均有不同效果的凝集作用,并表现出对O型人血和兔血的偏好性,TBL对酸碱及3种金属离子稳定,热变性温度为64℃。(2)用50μg/mL的TBL联合5×10-5 mol/L重组人白介素4 (rhIL-4)刺激未成熟DCs可促进外周血中树突状细胞的成熟和增殖,作用强于20 ng/mL的重组人肿瘤坏死因子α (rhTNF-α)。树突状细胞在含50μg/mL TBL的培养基中孵育48 h后,CD83和CD40表达上调,并且能释放促炎因子白介素10(IL-10)和白介素12(IL-12)。(3)采用细胞培养技术,以人淋巴瘤细胞株U937及小鼠肝癌细胞株H22为靶细胞,用不同浓度TBL体外处理,采用CCK-8检测细胞增殖、caspase试剂盒活性检测、流式细胞术检测细胞凋亡等方法研究TBL在体外对两种不同来源的肿瘤细胞增殖及细胞凋亡的影响。结果显示TBL在体外对人淋巴瘤细胞株U937和小鼠肝癌细胞株H22有较强的抑制生长作用,呈剂量依赖性关系。TBL还可以诱导人淋巴瘤U937细胞凋亡,当用TBL作用于肿瘤细胞后,caspase-8和caspase-9同时被激活,表明TBL可能通过诱导caspase-9直接激活caspase-8进而激活caspase-3来诱导肿瘤细胞发生凋亡。(4)采用黄芪、DCs移植及TBL-DCs联合移植方法对医用剂量为4 Gy的X射线直线加速器照射小鼠进行治疗,通过观察辐射损伤小鼠WBC和PLT、胸腺和脾指数、脾淋巴细胞增殖、外周血淋巴细胞亚群、骨髓细胞DNA含量和凋亡的影响来考查三种治疗方案对辐射损伤造成的造血系统和免疫系统的影响。结果显示,黄芪、DCs移植及TBL-DCs联合移植都能够增加受照小鼠外周血白细胞数、血小板数,提升受辐照小鼠的脾指数、胸腺指数及脾淋巴细胞增殖率,其中TBL-DCs移植组效果最好；TBL-DCs联合移植对治疗小鼠调节性T细胞CD4+25、B淋巴细胞、自然杀伤细胞CD16+损伤效果最佳,说明TBL-DCs联合移植对受辐射损伤小鼠造血系统和免疫系统有很好的保护作用。黄芪、DCs移植及TBL-DCs联合移植都能够增加受辐射小鼠骨髓细胞DNA含量,而DCs移植及TBL-DCs联合移植能降低骨髓细胞凋亡率,同时还有降低骨髓细胞微核率发生的作用,以TBL-DCs联合移植效果最佳；说明TBL-DCs联合移植能显著降低辐射导致的DNA损伤。以上表明,TBL-DCs联合移植不但对机体的造血系统有显著的保护作用,而且能够促进受辐射损伤机体造血功能的恢复,调节免疫系统,维持DNA微核等遗传物质的稳定,能显著保护机体免受电离辐射损伤。(5)用TBL刺激小鼠DCs,流式细胞术检测DCs表面抗原Dectin-1、CD40、CD80、CD86和MHCII的表达,ELISA检测Th17相关细胞因子IL-6和IL-23,Thl相关细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。实体瘤小鼠静脉注射TBL-DCs结果显示TBL刺激DCs Dectin-1信号途径,上调CD40、CD80、CD86和MHCII的表达刺激外周血单核细胞,增加各种炎性细胞因子的产生,活化效应性T淋巴来提高机体免疫力。通过对实体瘤小鼠静脉注射TBL-DCs研究发现,TBL-DCs不仅可以引起机体的适应性免疫反应而且可以同时引发全身性的抗肿瘤效应。TBL可能作为一种免疫增强剂在增强机体免疫反应、抑制肿瘤生长等方面具有显著的作用和发展的潜力。
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【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;Q946
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本文编号：2415368